艱難梭菌芽孢抑制劑的研究進展

翟 宇， 強翠欣， 趙建宏

作者單位： 河北醫科大學第二醫院，河北省臨床檢驗中心，石家莊 050000。

艱難梭菌（Clostridioides difficile）是一種專性厭氧、革蘭陽性桿菌，是重要的醫院感染致病菌。艱難梭菌可以產生毒素，形成芽孢，可引發感染，臨床表現可從輕度腹瀉至偽膜性結腸炎甚至死亡，病死率可達3%～15%[1]。艱難梭菌芽孢能夠抵抗不利的物理、化學和代謝條件[2]，對艱難梭菌存活、傳播起重要作用。艱難梭菌感染高復發率的原因可能是因為艱難梭菌以芽孢形式存在于患者的腸道后萌發成營養細胞（vegetative cell）所致[3]。目前，艱難梭菌感染的治療藥物主要是萬古霉素、甲硝唑或非達霉素等[4]。雖然抗生素初治有效，但是艱難梭菌感染患者初愈后復發率高達12%～40%[1]，并且首次復發后，再次復發率上升至64%[5]。所以抑制艱難梭菌芽孢的萌發和生長，對于控制艱難梭菌感染、傳播和復發非常重要。

1 消毒劑

1.1 過氧化氫

過氧化氫是一種強氧化劑，水溶液俗稱雙氧水，主要通過氧化細胞壁來殺滅細菌[6]。過氧化氫可以在病房使用，起到加強清潔和消毒的作用。Kenters等[7]對4種當地常用的消毒劑進行比較，通過計算菌落形成單位（colony forming unit，CFU）來測定艱難梭菌芽孢殺滅情況，結果表明含過氧化氫的消毒劑效果最好，對艱難梭菌RT010、027、014型芽孢均有抑制作用，采用過氧化氫濕巾擦拭方法減少量為5.29（95%CI5.04～5.54）log10CFU，而采用過氧化氫噴霧方法減少4.08（95%CI3.83～4.33）log10CFU，擦拭法對于艱難梭菌芽孢殺滅效果更好（P＜0.001）。

1.2 含氯消毒劑

用含氯消毒劑對醫院環境表面進行消毒是控制艱難梭菌傳播的主要措施[8]，含氯消毒劑主要對微生物的DNA或蛋白質等造成氧化損傷。含氯消毒劑抑制艱難梭菌芽孢的形成，因此可以降低艱難梭菌感染的罹患率。Goda等[9]將弱酸性氯化亞酸水（weakly acidified chlorous acid water，WACAW）和次氯酸鈉（NaClO）溶液對殺滅艱難梭菌芽孢的效果進行比較，結果顯示游離氯濃度為50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的WACAW均可在1 min內殺滅艱難梭菌芽孢數超過3.5 log10CFU，而只有當NaClO溶液的游離氯濃度達到200 mg/L時才能達到同樣的殺滅效果。因含氯消毒劑主要活性成分游離氯的氧化能力可以被有機物中和，有機物的存在會使NaClO的殺菌活性普遍降低，但是WACAW可經硫代硫酸鈉部分中和后恢復到初始水平，使之在有機物質富集環境下相對穩定，因此可能有助于處理被人類排泄物污染的環境表面。

1.3 酸化乙醇

接觸過艱難梭菌感染患者的醫護人員手套和衣服上有感染艱難梭菌芽孢的風險。Landelle等[10]發現24%接觸過艱難梭菌感染患者的醫護人員在摘手套后手上會有艱難梭菌芽孢殘留。含乙醇的洗手液對去除艱難梭菌芽孢無效，而用肥皂洗手去除艱難梭菌芽孢只是中等效果[11]。Tomas等[12]發現酸化乙醇，即用鹽酸調整pH為1.3的70%乙醇，能有效地快速清除醫護人員手套上的艱難梭菌芽孢，并且不會腐蝕衣物或引起呼吸道刺激。實驗將酸化乙醇與1∶10和1∶100稀釋的家用漂白劑（主要成分為NaClO）以及沒有調整pH值的70%乙醇進行比較，結果顯示酸化乙醇的滅菌效果相當于1∶100稀釋的家用漂白劑，消毒前后手套上艱難梭菌數量減少差異有統計學意義（P＜0.05），70%乙醇沒有抑制艱難梭菌芽孢的作用。但由于酸化乙醇對衣物沒有漂白作用，也沒有不良氣味刺激呼吸道。所以酸化乙醇比漂白劑和70%乙醇更適合于清除醫護人員手套上的艱難梭菌芽孢殘 留。

1.4 氯己定

氯己定又名洗必泰，是一種陽離子表面活性劑，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、酵母和包膜病毒有抗菌活性[13]，被廣泛應用于各種消毒劑和防腐劑中。氯己定是一種膜活性化合物，通過與細胞壁和質膜相關的負電荷相互作用，破壞營養細胞的保護性屏障。氯己定的抗菌活性對完整的休眠芽孢無效[14]，但是通過物理或化學方法來穿透或降解芽孢保護層，使氯己定進入芽孢后就可以發揮其抗菌活性。Nerandzic等[15]實驗證明，加熱、加入乙醇和升高pH均可提高氯己定對艱難梭菌芽孢的殺滅效果。艱難梭菌芽孢在80℃氯己定中暴露15 min后，實驗觀察到芽孢完全消除；加入70%乙醇的氯己定可在37℃時將艱難梭菌減少約1 log10CFU的時間從3 h縮短到1 h；將氯己定的pH從4提高到＞9.5，顯著提高了氯己定對艱難梭菌芽孢的殺滅作用（P＜0.001）。這些數據表明，改變物理或化學條件可以提高氯己定對艱難梭菌芽孢的殺菌活性。

2 抗菌藥物

2.1 非達霉素

非達霉素是2011年批準上市的一種大環內酯類抗生素，臨床Ⅲ期試驗證明非達霉素在治療艱難梭菌感染后25 d沒有復發，復發率低于萬古霉素[16]。有研究證明非達霉素與其主要代謝產物OP-1118能抑制艱難梭菌芽孢形成[16-17]。Babakhani等[17]將亞抑菌濃度的非達霉素加入早期穩定期的菌液中，之后每隔一段時間定量計算菌液中的總菌數和耐熱芽孢數，結果表明1/4 MIC的非達霉素及其主要代謝產物OP-1118即能抑制艱難梭菌芽孢形成，而相似亞抑菌濃度的萬古霉素、甲硝唑和利福平均不能抑制艱難梭菌芽孢形成。除抑制芽孢形成外，抑制艱難梭菌芽孢轉化為營養細胞，也是防止艱難梭菌感染復發的有效途徑。Allen等[18]研究表明雖然非達霉素并不會影響艱難梭菌芽孢的萌發，但可以抑制艱難梭菌芽孢萌發后營養細胞的生長從而減少艱難梭菌感染的復發和傳播[19]。

2.2 奧利萬星

奧利萬星是一種新型的半合成脂糖肽，具有良好的抗菌活性[20]。有報道稱，奧利萬星在體外腸道模型中對模擬艱難梭菌感染的治療非常有效，并且沒有誘導艱難梭菌感染的傾向[21-22]。雖然奧利萬星對艱難梭菌芽孢萌發沒有作用，但是可以減慢芽孢生長速度。Chilton等[23]用相差顯微鏡觀察4株艱難梭菌（分別為核糖體027、001、106、078型）在不同抗生素作用下折光性強、相對明亮（phase-bright）的芽孢，折光性弱、相對較暗（phase-dark）的芽孢和營養細胞的數量變化，結果表明，暴露于萬古霉素、甲硝唑和奧利萬星的芽孢從相對明亮轉變為相對較暗的速率與空白對照組相同， 24 h后萬古霉素和甲硝唑處理的芽孢從相對較暗生長為營養細胞的數量與空白對照組相當，80%芽孢生長為營養細胞；而奧利萬星處理的芽孢僅有20%從相對較暗生長為營養細胞。結果表明奧利萬星在亞抑菌濃度水平可以抑制芽孢由相對較暗向營養細胞的轉變，但不能抑制艱難梭菌芽孢由相對明亮轉變為相對較暗。

2.3 雷莫拉寧

雷莫拉寧是一種糖肽類抗生素，其作用機制是阻止細胞壁肽聚糖生物合成，對需氧和厭氧革蘭陽性菌包括對萬古霉素耐藥的腸球菌都有抗菌活性。Kraus等[24]通過體外模型實驗表明雷莫拉寧可以結合艱難梭菌芽孢，并且可以高效率地殺死艱難梭菌營養細胞。Freeman等[25]通過動物實驗證明雷莫拉寧在減少艱難梭菌芽孢形成和釋放方面優于萬古霉素，雷莫拉寧治療組盲腸內容物內仍有艱難梭菌芽孢的小鼠數量（6/23）比用萬古霉素治療組（19/23）少（P＜0.05）。

2.4 卡達唑胺

2.5 Ridinilazole

Ridinilazole前身為SMT19969，是一種新型的窄譜合成抗菌藥物。這一類新型雜環類抗菌藥物的作用機制尚未完全闡明，但目前已知ridinilazole可抑制細菌DNA合成[31-32]。此外，Bassères等[33]研究表明，與其他傳統的抗生素相比，ridinilazole可誘導艱難梭菌菌體延長、抑制分裂及芽孢形成。

2.6 Surotomycin

Surotomycin以前稱為CB-183315，是一種窄譜環脂肽類抗生素，適應證為艱難梭菌相關性腹瀉[34]。Aldape等[35]用surotomycin對3株艱難梭菌毒素產生和芽孢形成情況進行實驗，結果表明低濃度surotomycin [約（1～2）×10-3mg/L]可以抑制艱難梭菌毒素產生，同時劑量依賴性地減少了3株艱難梭菌芽孢的形成，這些結果有利于surotomycin用于艱難梭菌感染治療的新藥開發。

2.7 CRS3123

CRS3123前身為REP3123，是一種最近開發的全合成二芳基二胺抗菌藥物[36]，通過抑制細菌蛋白合成來抑制艱難梭菌生長和芽孢產生[37]。Ochsner等[38]在固體培養基上比較REP3123、萬古霉素和甲硝唑對艱難梭菌芽孢形成的作用。亞抑菌濃度下不同抗菌藥物處理后，艱難梭菌芽孢形成有不同變化。1/2 MIC和1/4 MIC濃度REP3123處理后所有菌株芽孢產量均有所下降；3株艱難梭菌在亞抑菌濃度甲硝唑處理后，芽孢產量顯著增加；2株艱難梭菌在亞抑菌濃度萬古霉素處理后，芽孢產量顯著增加。

3 益生菌與益生元

腸道菌群的不同代謝產物可干擾艱難梭菌感染的發病，阻止艱難梭菌芽孢的萌發。對于艱難梭菌感染特別是復發性艱難梭菌感染，替代療法建議以糞便移植的形式應用腸道益生菌，以糾正腸道菌群失調[39]。R?tsep等[40]實驗證明艱難梭菌的存在不影響植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的生長，但植物乳桿菌可以影響艱難梭菌的生長。將艱難梭菌與植物乳桿菌共同培養24 h后，15株艱難梭菌中有13株計數降至0；同時，在植物乳桿菌預孵育的BHI培養基中，艱難梭菌芽孢萌發延遲24 h，但在植物乳桿菌和木糖醇共同預孵育的BHI培養基中，48 h內完全抑制了艱難梭菌芽孢的萌發。木糖醇和植物乳桿菌共同作用可抑制艱難梭菌芽孢萌發和營養細胞形成，減少艱難梭菌在腸道內定植，為日后預防艱難梭菌感染及防止復發提供新的思路。

4 膽汁酸

4.1 次級膽汁酸

人體肝臟中的初級膽汁酸進入腸道在細菌的作用下與牛磺酸或甘氨酸結合形成次級膽汁酸[41]。牛磺膽酸（TCA）可以刺激艱難梭菌芽孢萌發，而鵝脫氧膽酸（CDCA）是TCA介導的艱難梭菌芽孢萌發過程的拮抗劑，0.04% CDCA即可抑制艱難梭菌芽孢萌發[42]。人體腸道內大約有50種次級膽汁酸，小鼠體內有2種人體中不存在的膽汁酸，即α-鼠膽酸（AMA）和β-鼠膽酸（BMA）。ω- 鼠膽酸（OMA） 是由正常菌群產生的BMA異構體。Thanissery等[43]對常見的次級膽汁酸，如脫氧膽酸（DCA）、石膽酸（LCA）、熊脫氧膽酸（UDCA）、脫氧膽酸羥化物（iDCA）、石膽酸羥化物（iLCA）、OMA和豬脫氧膽酸（HDCA）在艱難梭菌芽孢萌發、生長和毒素產生方面進行體外試驗。結果顯示0.2% DCA和0.1% iLCA即可有效抑制實驗所用的7株不同型別的艱難梭菌芽孢萌發，其他5種次級膽汁酸至少抑制了5株艱難梭菌芽孢萌發。Francis等[44]針對不同濃度鼠膽酸對艱難梭菌芽孢萌發影響情況進行比較，結果表明3種鼠膽酸均能在體外抑制艱難梭菌芽孢萌發，并且BMA比AMA更有效。由于次級膽汁酸可以改變艱難梭菌的生長周期，這意味著未來次級膽汁酸可以成為潛在的艱難梭菌感染治療方法，但目前還需要在機制方面深入研究。

4.2 膽汁酸衍生物

人體中CDCA抑制艱難梭菌芽孢的萌發，但是抗生素會使膽汁酸代謝紊亂而影響CDCA的釋放；另一種抑制艱難梭菌芽孢萌發的內源性膽汁酸UDCA，由于必須從回腸重吸收到腸肝循環中，不能在結腸內達到抑制艱難梭菌芽孢所需的濃度。Stoltz等[45]對CDCA和UDCA進行化學修飾，用核糖體027型艱難梭菌對合成的化合物進行篩選，結果表明UDCA的C24酰胺或四唑衍生物是最有效的化合物，此外C3的取代物耐受良好，而C7的取代物通常會降低化合物的抑制活性。Howerton等[46]發現一種膽酸甲苯磺酸衍生物CamSA能夠抑制艱難梭菌芽孢在小鼠體內萌發。研究者用大量的艱難梭菌芽孢感染小鼠，之后給予小鼠不同濃度的CamSA并監測癥狀，同時對糞便中艱難梭菌芽孢和營養細胞進行計數。結果發現在沒有觀察到藥物毒性的情況下，50 mg/ kg CamSA可以避免感染艱難梭菌芽孢的小鼠發展為艱難梭菌感染，但是無法避免感染艱難梭菌營養細胞的小鼠發展為艱難梭菌感染。較低劑量的CamSA可延緩艱難梭菌感染發作并減輕癥狀。CamSA可以通過抑制艱難梭菌芽孢萌發為營養細胞，從而抑制艱難梭菌感 染。

5 天然產物及其提取物

5.1 香芹酚

香芹酚是一種單萜類苯酚，來源于植物的食品級化合物，有抗菌和抗炎的功效。體外試驗表明，香芹酚能有效地抑制艱難梭菌產生毒素，而不影響人類正常胃腸道菌群[47]。Mooyottu等[48]繼續就香芹酚對艱難梭菌芽孢產生、萌發和生長等方面進行試驗。研究者將亞抑菌濃度的香芹酚加入到含艱難梭菌的肉湯中，之后對艱難梭菌營養細胞和芽孢進行計數，結果顯示香芹酚對艱難梭菌營養細胞數量沒有影響，48 h、72 h、96 h的艱難梭菌芽孢產生量比對照組顯著減少，證明香芹酚可以抑制艱難梭菌芽孢產生；同時對艱難梭菌芽孢萌發生長曲線進行監測，結果顯示亞抑菌濃度的香芹酚可以減少艱難梭菌芽孢生長成營養細胞，而最低抑菌濃度的香芹酚可以完全抑制艱難梭菌芽孢生長成營養細胞；同時研究者發現香芹酚顯著下調了艱難梭菌芽孢相關基因表達，如spo0A、spo IIR、spoIIID、sigH和CD2492。

5.2 Rhodomyrtone

Rhodomyrtone是一種來自玫瑰桃金娘草葉子的天然小分子物質，對革蘭陽性菌具有強大的殺菌活性，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和產芽孢的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌[49]。Srisuwan等[50]對比了rhodomyrtone和萬古霉素對艱難梭菌芽孢生長的作用。結果表明rhodomyrtone和萬古霉素抑制艱難梭菌芽孢生長的濃度分別為0.625 mg/L和2.5 mg/L。Rhodomyrtone對艱難梭菌芽孢生長為營養細胞的抑制作用是萬古霉素的4倍。

6 納米材料

如今，納米材料在醫學中的應用越來越多，一些有顯著抗微生物活性納米材料如銀、氧化鋅和氧化鈦納米顆粒已被用作替代殺菌劑。抗菌機制可能與產生活性氧、破壞細胞膜、結合硫醇基團以及釋放有毒離子等有關[51]。含鐵顆粒通常被認為是具有高度生物相容性的納米材料。最近報道一些特定的氧化鐵納米顆粒具有抗菌活性[52]。Lee等[53]評估Fe3-δO4納米顆粒能否抑制體內艱難梭菌芽孢萌發。將艱難梭菌芽孢在0.5 μg/L Fe3-δO4中處理20 min，有64%不能萌發為營養細胞。Fe3-δO4通過與芽孢表面蛋白結合，減少芽孢釋放吡啶二羧酸（DPA）從而抑制艱難梭菌芽孢萌發。在艱難梭菌感染動物模型中，用Fe3-δO4處理過的艱難梭菌芽孢感染小鼠，小鼠結腸炎發病率下降為原來的1/3，并且Fe3-δO4對小鼠腸道菌群沒有影響。

隨著艱難梭菌感染發病率的增加和高產毒株027/NAP1/BI的暴發流行，艱難梭菌感染成為世界范圍內不斷增長的公共健康問題[54]。艱難梭菌在醫院和療養院中的高度傳播與環境中具有大量高抵抗力的芽孢有關[55]。盡管毒素是導致艱難梭菌感染的主要致病因素，但艱難梭菌芽孢形成、萌發和生長為營養細胞是艱難梭菌感染傳播和復發的重要因素。復發是艱難梭菌感染的主要問題，有20%～30%患者有至少一次復發的經歷[56]。所以，選用合理有效的消毒劑和藥物是阻止艱難梭菌芽孢傳播和抑制芽孢復發的重要措施。