海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau、α-Synuclein的意義

黃仕美

【摘 要】目的：觀察海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達變化及相互關系，以探討神經元內易聚蛋白磷酸化Tau、α-Synuclein與海洛因致神經元損傷的關系。方法：建立海洛因成癮大鼠模型，SD大鼠隨機分為短時組2w、長時組4w及對照組。采用免疫組織化學方法，顯示海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau、α-Synuclein的表達變化。結果：海洛因依賴大鼠海馬CA1區中磷酸化Tau、α-Synuclein的表達均較對照組顯著升高，長時組高于短時組（P<0.05）。海洛因依賴組中磷酸化Tau與α-Synuclein的表達水平呈正相關（r=0.436，p<0.05）。結論：海洛因中毒可引起神經元內磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein異常聚集。

【關鍵詞】海洛因;磷酸化Tau;α-Synuclein;海馬CA1

阿片類毒品對人類的危害被社會各界廣泛關注，海洛因依賴者比例有逐年升高的趨勢[1]。大量研究表明，海洛因依賴可導致廣泛神經元變性壞死、萎縮退化及脫髓鞘改變，且海洛因依賴被認為是一種與記憶、癡呆癥相關的慢性、復發性神經變性疾病[2]。我們前期研究也發現，海洛因依賴大鼠額葉、海馬區均出現神經元數量減少、神經元變性、嗜神經現象等形態學改變。

大多數神經變性疾病共同病理特征是神經元內存在易聚集蛋白，如Tau 蛋白、突變的α-突觸核蛋白（α-synuclein）、淀粉樣前體蛋白、Huntingtin蛋白等，它們對神經元產生毒性作用，最終導致神經元的死亡而出現相應的臨床癥狀[3]。國內外對于海洛因成癮及復吸所引起的神經損害是否也與易聚集蛋白的毒性作用有關尚未見報道。本文通過研究海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein表達水平的變化，探討海洛因依賴腦損傷機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康SD大鼠30只，購自貴州醫科大學實驗動物中心。3月齡，體重200-220g，雌雄各半。

1.1.2 藥品和試劑

海洛因由貴州省公安廳提供。磷酸化Tau蛋白（Rabbit Anti-P-Tau protein）購自北京博奧森;α-核突觸蛋白（α-Synuclein）購自Santa公司;生物素化二抗（山羊抗兔IgG、鼠抗兔IgG）購自北京博奧森公司，其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物模型

經過適應性喂養一周后，按體重及性別隨機分為3組，每組10只，長時組（皮下注射海洛因4w），短時組（皮下注射海洛因2w），正常對照組（皮下注射等量生理鹽水），飼養期分別為2周和4周，參照以往文獻成功復制海洛因依賴模型的方法，給予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次劑量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續9天（第9天每次劑量達27mg/kg）。對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察動物生長發育狀況及體重變化情況。第10天用5 .0 mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發戒斷癥狀觀察30min，對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進行評分，確認海洛因依賴模型成功。短時組繼續皮下注射27mg/kg海洛因4天（共計2周），每天2次;長時組繼續皮下注射27mg/kg海洛因18天（共計4周），每天2次。生理鹽水對照組各5只大鼠分別采用與模型組相同劑量的生理鹽水注射2周、4周。

1.2.2 動物行為變化觀察

觀察大鼠毛色、飲食、活動情況、精神狀態，用電子秤稱量大鼠體重。參照Seebers等評分標準，進行大鼠催促戒斷癥狀評分。

1.2.3 取材和標本制備

各組大鼠分別用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，參照鼠腦立體定位圖譜冠狀取海馬CA1區腦組織（包含周邊組織）。

1.2.4 免疫組織化學Envision法

切片常規脫蠟至水，0.01mol/L枸緣酸鈉緩沖溶液（PH6.0）微波抗原修復，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，3%H2O2室溫避光孵育10分鐘，除去內源性過氧化氫酶，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀釋）37℃恒溫箱中消化20min，使抗原位點暴露，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，分別滴加一抗磷酸化Tau蛋白、α--Synuclein （用PBS稀釋1：100、1：100），4℃冰箱孵育過夜，復溫，PBS沖洗3次，5min/次，磷酸化Tau蛋白滴加兔二抗IgG（PV6001），α--Synuclein滴加鼠二抗IgG（PV6002），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，5min/次，DAB液顯色，蘇木精輕度復染，常規脫水、透明、封片。

1.2.5 圖像分析

通過Biomias 2000 圖像分析系統進行計算分析，具有陽性表達的區域隨機選取4個視野，每個視野隨機選取陽性表達部位進行平均灰度值測定，平均灰度高則表達強，反之則弱。

1.3 統計方法

運用SPSS 19.0統計軟件數據包進行數據分析，用均數±標準差（D）表示，兩組間的比較采用獨立樣本T檢驗的分析方法;相關性分析采用Pearson直線相關分析法。相關系數采用r表示，以P<0.05表示與對照組相比差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組相關蛋白表達比較（見表1）

異常磷酸化Tau蛋白陽性表達存在于海馬神經元胞質和軸突中，以軸突最為明顯;α-Synuclein蛋白主要集中在海馬神經元核周胞質及突觸終末;細胞外均未見表達。免疫組織化學定量分析，磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達水平為：長時組>短時組>對照組，統計有顯著差異，P<0.05。

2.2 大鼠腦組織中磷酸化Tau蛋白與α-Synuclein的關系

海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau水平與相應時程用藥組的α-Synuclein蛋白水平呈正相關（0

3 討論

海洛因是成癮性極強的嗎啡衍生物，它由嗎啡經乙酰化制成，具有較嗎啡更大的脂溶性，更易于通過血腦屏障以及對腦獎賞性刺激。研究發現[4]，產生成癮和復吸行為的中樞主要在中腦邊緣系統。這個體系與動機、獎賞、心理強化等心理形成有關，中腦邊緣系統中的海馬、前額葉皮質是空間學習記憶的核心中樞， 多年來已成為研究學習與記憶機制的重要解剖結構。臨床和動物試驗均發現海洛因成癮可引起海馬缺氧缺血病理損害，而大鼠背側海馬CA1區對缺氧缺血更加敏感[5]。可見海馬CA1區是學習記憶的核心中樞，在以記憶、癡呆相關的神經變性疾病（如AD、海洛因成癮等）中，易產生神經元變性、缺失而出現明顯病理學改變。我們前期研究發現，海洛因依賴成癮可致額葉、海馬區腦組織的泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）表達量減少，且泛素化水平降低，推測泛素蛋白酶體系功能紊亂可能是海洛因對大鼠成癮復吸或腦組織損害的原因之一。而泛素蛋白酶體系統具有識別磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白等多余的和錯誤折疊的蛋白質，以保持細胞內蛋白質平衡的作用。因此，本研究通過檢測海洛因依賴大鼠海馬CA1區磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達變化及相互關系，探討易聚蛋白與海洛因致神經元損傷的關系。

Tau蛋白是一種神經元微管相關細胞骨架蛋白，正常情況下廣泛存在于神經元內，軸突含量很高。異常磷酸化可以引起Tau蛋白錯誤折疊，形成配對螺旋樣二聚體（paired helical filaments，PHFs），是神經原纖維纏結的主要成份，具有減弱順向軸漿運輸等作用，對神經細胞的正常功能產生不利的影響。以往研究還發現[2，5]，海洛因成癮復吸大鼠光鏡、電鏡觀察腦內結構見軸突、樹突中神經微管和神經微絲崩解。在軸突中，含量最高的微管相關蛋白是Tau蛋白，其功能由磷酸化狀態調節，過度磷酸化的Tau蛋白喪失了促進微管組裝的活性，使微管組裝降低，最終導致神經元退行性變。最具代表性的神經元退行性變的疾病是人類的阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）。我們通過免疫組織化學法檢測發現，異常磷酸化Tau蛋白廣泛定位于大腦皮質及海馬神經元胞質和軸突中，以軸突最為明顯，細胞外未見表達，異常磷酸化Tau蛋白陽性表達在各組的表達水平為：長時組>短時組>對照組，統計有顯著差異，P<0.05。α-Synuclein蛋白是一種前突觸蛋白，主要在神經組織中表達，是淀粉樣蛋白斑塊（NAC）的前體蛋白（NACP）。α-Synuclein蛋白異常聚集也可以引起神經組織退化疾病，如肌萎縮側索硬化癥、帕金森病、路易體癡呆等。研究還表明，Tau蛋白、微管蛋白、A-β肽等蛋白質能促進α-Synuclein蛋白的異常聚集[6]。因此，本次實驗同時檢測了α-Synuclein蛋白表達，在海洛因依賴大鼠海馬CA1區，α-Synuclein蛋白出現了與異常磷酸化Tau陽性相似的陽性表達，即：長時組>短時組>對照組，統計有顯著差異，P<0.05。

本研究結果顯示，海洛因依賴大鼠海馬CA1區的磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白水平均顯著下降，且隨藥物依賴時間遞增，表明磷酸化Tau蛋白的異常聚集可能誘發了α-Synuclein蛋白的異常聚集。同時，二者蛋白表達呈正相關，提示二者可能協同參與了海洛因成癮復吸或腦損傷機制，其異常聚集打破了泛素蛋白酶降解體系的調節平衡，使錯誤折疊蛋白異常聚集，引起神經元一系列退行性變，最終造成海洛因依賴腦組織受損和功能障礙。

參考文獻

[1]胡赟，梁文妹，李一欣等.海洛因依賴大鼠頜下腺IL-1、TNF表達的改變[J]，實驗動物科學，2017，34（6）：1-5.

[2]蔡興慧，宋小鴿，張榮軍.針刺對海洛因復吸大鼠腦神經元超微結構變化的影響[J].中國藥物依賴性雜志，2012，21（1）：26-29.

[3]劉英華，羅健東.蛋白酶體活性抑制對大鼠海馬tau蛋白的泛素化影響[J].實用醫學雜志，2011，27（3）：386-389.

[4]俞發榮，李建軍，俞鑫等.干預措施對精神依賴藥物成癮生理生化機制的影響[J].中國實驗動物學報，2018，26（6）：799-803.

[5]鄺滿元，鄧鵬程，徐松.嗎啡成癮戒斷對大鼠海馬CA1 區P-CREB表達的影響[J].解剖學研究，2009，31（1）：50-53.

[6]焦璐琰.α-核突觸蛋白（α-Synuclein）和Tau相互作用的研究進展[J].解剖學研究，2016，38 （2）：143-147.