植物響應鹽脅迫蛋白質組學研究進展

王 哲，柴里昂，樊懷福，2，杜長霞，2，*

(1.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江農林大學 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311300)

土壤中的鹽離子大量積累，植物根系周圍的土壤滲透勢降低，阻礙根系對營養物質和水分的吸收，降低營養物質的利用率和有效性，導致植物水分吸收和新陳代謝能力紊亂。日益嚴重的設施土壤次生鹽漬化已成為制約我國農業生產以及設施農業可持續發展的主要非生物脅迫環境因素之一，對植物的危害主要有滲透脅迫和離子傷害[1]，其次還有氧化應激、離子不平衡或營養缺乏等[2]，嚴重影響了植物的光合作用、蛋白質和脂質代謝等生命過程。在長期演化進程中，植物形成了一系列如離子轉運及區隔化、形成滲透調節物質及代謝物、提高抗氧化酶積累及活力、調節信號轉導因子及鹽脅迫相關基因的表達等防御機制來維持離子和滲透平衡[3]。植物體內大量存在的可溶性蛋白作為參與各種代謝與調節的酶，其含量變化是植物體在脅迫下(如鹽脅迫)總代謝水平的一個重要參數[4]。蛋白質組學研究的核心技術是蛋白質的提取與分離，常用的技術有：雙向電泳、熒光差異雙向凝膠電泳、同位素親和標簽、同位素標記相對和絕對定量技術和蛋白芯片技術等。為監測植物蛋白質響應鹽脅迫的動態變化，探索植物耐鹽機理，豐富基因組信息資源，本文比較分析了甜土植物與鹽生植物響應鹽脅迫的表達情況，為作物抗鹽品種改良和鹽生植物作物化等提供參考。

1 不同植物類群鹽脅迫響應蛋白質組學

依據植物對鹽脅迫忍受能力或在鹽漬生境的適應能力，將植物分為鹽生植物和甜土植物。鹽生植物是一類能在約200 mmol·L-1或更高的鹽濃度環境中存活和繁殖的植物[5]，而在這種環境下不能正常生長和完成生活史的植物就是甜土植物。植物響應鹽脅迫過程中，許多基因被激活表達或者表達受到抑制，導致參與響應鹽脅迫的蛋白種類和數量大幅增加。因此，利用蛋白質組學技術挖掘各種植物在鹽脅迫下的差異蛋白種類、數量及其變化規律，預測相關基因的種類、數量及其變化規律，為深入了解植物抗鹽分子機制提供重要線索。

1.1 甜土植物

蛋白質組學技術為深入分析植物應對鹽脅迫的代謝和調控機制提供了強有力的技術支撐，前人分析了黃瓜(Cucumissativus)[6]、玉米(Zeamays)[7]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8-9]、水稻(Oryzasativa)[10-12]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[13]、番茄(Lycopersiconesculentum)[14]、陸地棉(Gossypiumhirsutum)[15]、大豆(Glycinemax)[16]、大麥(Hordeumvulgare)[17]、葡萄(Vitisvinifera)[18-19]和豌豆(Pisumsativum)[20]等不同亞細胞結構、細胞、組織器官、個體響應鹽脅迫差異蛋白變化的特征及規律。蛋白質組學分析表明，多數甜土植物鹽脅迫應答蛋白質主要參與形態結構、碳和能量代謝、脅迫防御、核酸調控、激素合成、信號轉導等過程。

1.1.1 形態結構相關蛋白

鹽脅迫下，植物通過提高對逆境的適應能力來降低傷害程度，其結構形態必然發生變化。鹽脅迫使植物的生殖發育進程提前，生長速率降低，植物葉面積減少，導致植物碳同化量的減少，進而抑制植物組織和器官的生長分化[21]。在研究葡萄不同組織應答鹽脅迫中發現，根中有21種蛋白發生變化，而葉片和莖尖則分別有14和13種蛋白發生差異表達[18]，說明葡萄不同組織中的蛋白質組應答鹽脅迫的表達有所不同，推測植物的不同組織感知鹽脅迫時期不同，根部最先感知鹽脅迫。鹽脅迫能改變大豆一些胚軸和胚根部特殊蛋白的表達，晚期豐富蛋白、β-伴大豆球蛋白、堿性螺旋-環-螺旋蛋白等表達量上調，血凝素和31 ku糖蛋白前體蛋白等表達量下調，據此推測，這些蛋白質可能在大豆適應鹽脅迫環境過程中發揮重要作用[16]。肌動蛋白纖維網絡控制并維持真核細胞正常形態及內部構造，參與多種生理活動，且多種細胞因子均具備形成一種特定的新肌動蛋白纖維網絡的能力。鹽脅迫下水稻根肌動蛋白表達量上調[10]，但紫花苜蓿根中的肌動蛋白表達量卻下調[13]，這表明不同植物的肌動蛋白在鹽脅迫下表達具有復雜性，表達量的差異可能與不同植物的耐鹽性有關。在逆境下野生西瓜(Citrulluslanatus)參與木質素生物合成的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶和過氧化物酶活性增強[22]，表明木質素的增加可增強細胞壁的硬度，防止土壤中根的干枯。細胞骨架在生物和非生物等各種脅迫下迅速重塑得益于多種膜聯蛋白[23]，β-微管蛋白等骨架蛋白表達量上調[24]，這也許是植物自身機制對鹽脅迫的應答，在生物膜的構成、離子通道建立等方面具有重要作用。

1.1.2 碳和能量代謝相關蛋白

植物響應鹽脅迫不僅僅表現在形態結構方面，在碳和能量代謝方面表現也很突出，碳和能量代謝的改變涉及糖酵解、三羧酸循環、電子傳遞鏈和ATP合成等高豐度酶的參與。在黃瓜[6]、番茄[14]根部觀察到大量的糖酵解酶的存在，植物通過提高糖酵解酶的數量和活性來促進能量代謝，從而適應鹽脅迫。同時擬南芥[8]、豌豆[20]中三羧酸循環途徑能量代謝相關酶(α酮戊二酸脫羧酶、丙酮酸脫氫酶)表達量均上調，表明充足的能源是植物能夠適應鹽環境的主要條件之一。鹽脅迫影響作物產量與脅迫條件下光合作用降低密切相關[25]，鹽脅迫對光合作用的抑制是多方面的，既包括對CO2的吸收、運輸及固定的影響，碳同化降低，也包括對光能的吸收、轉運和電子傳遞的影響，還可能影響原初產物的利用、轉運及分配。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合碳循環反應中重要的羧化酶，也是光呼吸途徑必需的加氧酶，在光合作用暗反應中起著重要的作用[26]，增加Rubisco活化酶可大大提高Rubisco活性的固定量和利用率，對提高光合作用效率至關重要，紫花苜蓿葉片響應鹽脅迫過程中光能的利用降低，可能是Rubisco表達下調導致的[13]。另外，植物中的光合碳固定蛋白酶、光系統Ⅱ復合體等在鹽脅迫下發生差異表達，導致光合作用及作物產量下降[22]。擬南芥[9]在150 mmol·L-1NaCl處理后，葉綠素a/b結合蛋白、放氧復合體的33 ku和光系統Ⅰ捕光色素結合蛋白等這三種與光反應有關的膜蛋白表達明顯上調，保證了植物在鹽脅迫過程中存有足夠能量，通過提高光合作用能力來提高其對鹽脅迫的適應性。

1.1.3 信號轉導相關蛋白

利用蛋白質組學技術檢測到許多參與信號感知及轉導的蛋白質，包括質膜受體或細胞質內受體、Ca2+信號傳導蛋白等[27]，在鹽脅迫下表達豐度發生顯著變化。小G蛋白具有與G蛋白相似的功能，在細胞信號轉導通路中起著分子開關的作用[28]，參與感受胞外刺激，且能通過不同的細胞內信號轉導來響應這些刺激。高鹽脅迫下水稻[12]中G蛋白、Rab5B、小GTP結合蛋白的表達量均上調，而水稻[11]中鈣調蛋白、鈣網蛋白與鈣網蛋白前體、液泡鈣結合蛋白相關蛋白表達下調，由此證明，不同植物或同一植物的不同器官響應鹽脅迫時信號轉導蛋白表達量不同，可能是因為耐鹽性不同。信號級聯調控不同的下游通路是植物抗逆性的關鍵，在玉米高鹽脅迫過程中檢測到與Ca2+相關的鈣調蛋白和鈣黏蛋白等信號蛋白，揭示了糖信號和細胞信號通路，并暗示了一個與NaCl誘導信號有關的轉導鏈[7]。同時Colcombet等[29]對植物響應鹽脅迫的信號轉導途徑進行了歸納，包括：鹽過敏感信號轉導途徑、鈣依賴型蛋白激酶級聯反應途徑、脫落酸信號通路、磷脂信號通路和促分裂原活化蛋白激酶級聯途徑等誘導信號轉導途徑。植物蛋白激酶通過ABA介導的信號通路來增強植株對鹽的耐性，且通過獨立于ABA的信號通路調控胞內能量狀態，維持離子平衡[30]。磷脂信號通路和促分裂原活化蛋白激酶通過激活下游的酶、轉錄因子等應答因子將胞外的環境信號傳遞到細胞內，引起胞內轉錄及代謝水平的變化，進而調控細胞內脅迫應答反應[31]。在黃瓜[32]、大豆[33]等響應鹽脅迫的過程中，MKK1和MAPK過表達會提高植株抗氧化酶的活性、增強植株的耐鹽性，GMK1從胞質轉移到細胞核中，激活轉錄因子來響應脅迫。據此推測，植物通過自身復雜信號轉導系統的調控增強了對鹽逆境的適應性及耐受性，這些途徑在植物抗逆信號轉導過程中起到樞紐作用。

1.1.4 脅迫防御相關蛋白

植物抗氧化系統相關蛋白是防御系統蛋白的一部分，在響應鹽脅迫過程中發揮重要作用。在研究鹽脅迫對黃瓜幼苗韌皮部滲出液超氧化物歧化酶，過氧化物酶和過氧化氫酶同工酶表達影響過程中，發現3種同工酶與其耐鹽性均有密切關系，而且表達具有品種及組織特異性[34]。陸地棉幼苗根系在響應鹽脅迫過程中，抗壞血酸氧化酶、谷胱甘肽轉移酶的同源蛋白表達顯著上調[15]。抗壞血酸氧化酶作為植物體中多銅氧化酶家族的主要成員之一，它能使抗壞血酸氧化成水和脫氫抗壞血酸，從而維持質體外氧化還原動態平衡；谷胱甘肽轉移酶能催化親核性的谷胱甘肽與親電子外源化學物的結合反應，降低植物體內活性氧水平，從而達到解毒目的[35]。在不同耐鹽型大麥蛋白質組響應鹽脅迫研究中發現，耐鹽性強的大麥根系中積累了較多與活性氧清除相關的蛋白[17]。在上述酶的保護下，植物細胞可以避免鹽脅迫的氧化損傷。植物凝集素是一類具有特異糖結合活性的蛋白，可作為防御蛋白在植物響應鹽脅迫中發揮作用[36]，是植物防御蛋白系統重要的組成部分，在植物保護上起著重要作用，且不同物種間利用凝集素應對脅迫的機制存在差異。鹽脅迫下，水稻根中的甘露糖結合凝集素表達均上調[10]，但是大豆根中凝集素表達下調[16]。

1.1.5 植物激素合成和核酸調控相關蛋白

除此之外，植物激素合成和核酸調控類蛋白也受到了鹽脅迫的影響。植物激素一定程度上能夠緩解鹽脅迫對植物的傷害，對植物生長發育有重要的調控作用，且在植株不同的生長階段響應鹽脅迫時表達量存在差異，如在植株營養生長和生殖生長階段響應鹽脅迫的表達量存在顯著差異[37]。一些miRNAs在鹽處理下表達下調，因此釋放miRNA介導對ARF基因的抑制，并觸發生長素信號，激活各種耐鹽相關通路的下游成分[38]。植株感受到脅迫信號后，通過上調內源ABA的表達量，下調CTK和GA的表達量，誘導離子轉運蛋白、抗氧化物酶及滲透調節物質合成相關蛋白等鹽脅迫相關蛋白表達，植株表現出代謝減緩、生長抑制等現象，以增強植物的耐鹽性[37]。因此，鹽脅迫下植物通過各種激素間協作與平衡來調節自身內源激素水平，并不僅僅依賴某種激素含量的高低來適應環境。AGO(Argonaute)蛋白家族成員在小核糖核酸(RNA)介導轉錄后調控中有重要作用[39]，在病毒中也起著關鍵作用[40]。在擬南芥AGO家族基因的10種基因響應鹽脅迫研究中，發現AGO2、AGO3和AGO7在鹽脅迫下被誘導表達強烈，而且AGO家族基因存在顯著的表達差異性[41]。鹽脅迫下CsbZIP4轉錄因子在茶樹葉片中表達上調2.9倍，而在根中表達顯著被抑制，下調2倍，且CsbZIP4的過表達能夠降低轉基因株系種子萌發時對鹽脅迫的敏感性，增強其抗性，說明CsbZIP4與茶樹抵御鹽脅迫密切相關[42]。

1.2 鹽生植物

中國鹽生植物種類為502種[43]，多種具有重要的經濟、科研價值，是一類不可多得的重要經濟植物。鹽生植物有較強的抗鹽優勢，具有重要的研究價值。前人研究了紅海欖(Rhizophorastylosa)[44]、星星草(Puccinelliatenuiflora)[45]、鹽角草(Salicorniaeuropaea)[46]、海紫苑(Astertripolium)[47]、角堿蓬(Suaedacorniculate)[48]、獐毛(Aeluropuslittoralis)[49]、鹽芥(Thellungiellasalsuginea)[24]、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)[50]和鹽穗木(Halostachyscaspica)[51]等鹽生植物對鹽脅迫的響應，通過蛋白質組學技術發現差異蛋白主要涉及代謝和轉導相關蛋白，其次是滲透調節和活性氧清除相關蛋白。

1.2.1 代謝和轉導類蛋白

MutT/Pnudix類蛋白啟動類異戊二烯在細胞內的生物合成途徑，有助于保護自身免遭鹽脅迫侵害和適應鹽脅迫環境。鹽脅迫下，紅海欖[44]中MutT/Pnudix類蛋白表達顯著上調，說明此類蛋白與鹽脅迫相關。固定CO2關鍵酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性隨鹽度升高而增強，表明鹽分有利于紅海欖向C4植物光合代謝途徑轉變，增強光合速率[52]，但紅海欖的水分利用效率和最大光合速率均隨鹽度升高而降低，說明高鹽脅迫下鹽生植物光合作用也會受到抑制。且不同栽培方式下，響應鹽脅迫的差異蛋白不同，鹽水栽培下，上調表達蛋白與脅迫防御相關，淡水栽培下，上調表達蛋白與能量代謝相關。在不同鹽脅迫下，星星草[45]、角堿蓬[48]、冰葉日中花[50]應答鹽脅迫的差異蛋白表達量不同。黃烷酮-3-羥化酶、富含甘氨酸RNA結合蛋白、細胞色素P450、真核翻譯起始因子蛋白eIF5A在NaHCO3脅迫下，表達量均顯著高于NaCl脅迫，這些蛋白主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝等過程。植物可能通過增強蛋白質合成及降解能力、提高脯氨酸含量等途徑來提高抗鹽能力。獐毛嫩枝響應鹽脅迫的差異蛋白量隨著NaCl濃度的升高而增加，主要參與碳水化合物的合成、能量和蛋白質代謝、光合作用和信號轉導等過程[49]。而在鹽脅迫下杜氏藻(Dunaliellabardawil)[53]細胞的蛋白質組學研究中，共發現54種差異蛋白質，涉及蛋白質和膜的結構穩定與信號轉導途徑。

1.2.2 滲透調節和活性氧清除相關蛋白

不同鹽脅迫下鹽穗木的共同差異表達蛋白主要表現在細胞過程、代謝過程和信號轉導等類別中，上調表達蛋白主要涉及滲透調節(海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶D、磷酸乙醇胺N-甲基轉移酶)和活性氧清除的相關蛋白(硫氧還蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶)，說明鹽穗木能夠通過促進滲透調節和增強活性氧清除來提高短期鹽脅迫適應能力[51]。鹽生植物固有的耐鹽能力使其成為了解鹽生植物對高鹽度適應機制的模型。鹽刺激后信號傳遞和激活能力是鹽生植物在鹽水環境中生存的關鍵。高鹽度脅迫還能誘導植物激素的合成，特別是ABA[54]和特定基因表達和代謝產物合成的調控。ROS在應激下產生，參與涉及Ca2+信號傳導、磷脂信號、MAPK活化以及脫落酸等轉導過程[55]。因此，鹽生植物蛋白質組研究促進了我們對其在高鹽度條件下適應性的理解，包括通過鹽腺分泌鹽、調節細胞離子穩態和滲透壓、活性氧的解毒以及膜組成的改變；通過改變光合作用與能量代謝模式提供更多能量來維持相對正常的代謝水平，并增強酶和蛋白質活性，維持植物體內離子平衡，從而實現更有效的ROS解毒和離子分離轉運，從而提高抗鹽能力。

2 甜土植物與鹽生植物鹽脅迫響應蛋白質組學的異同

甜土植物和鹽生植物在響應鹽脅迫時差異蛋白質數量及種類方面有顯著差異，在機制和防御途徑上有相似點。

相同點：①甜土植物和鹽生植物響應鹽脅迫的差異蛋白主要參與碳和能量代謝(丙酮酸磷酸雙激酶)、脅迫抗性(類鈣調磷酸酶亞基B蛋白質)、維持細胞或亞細胞形態結構穩定(β-微管蛋白)、信息傳遞(鈣依賴蛋白激酶)等過程，在功能和目的上相似。②鹽生植物和甜土植物都是通過在細胞內積累有機溶質(脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等)而獲得滲透調節作用，維持和保護細胞及生物活性物質的功能正常運行，保持其組織的多種代謝物質(脂類、蛋白質、碳水化合物和核酸等)不受破壞的作用。

差異點：①鹽生植物具有通過進化獲得的獨特的鹽脅迫應答模式。表達模式不同的蛋白如Rubisco及其相關蛋白質、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和超氧化物歧化酶，主要參與光合作用、形態結構、能量代謝及脅迫防御信號轉導等過程，表明鹽生植物可能部分含有與甜土植物相同或相似的抗逆基因或蛋白質。但在脅迫應答過程中這些蛋白質的表達模式存在差異，從而使得鹽生植物具有更強的適應和抵御鹽脅迫的能力。②鹽生植物鹽脅迫應答過程中具有特異的蛋白質表達：包括光合作用相關蛋白(低CO2誘導蛋白)、碳和能量代謝相關酶(NADPH脫氫酶)、核酸代謝相關酶(焦磷酸磷酸水解酶)、脅迫防御相關蛋白(過氧化物酶體發生因子)、轉運蛋白(銨轉運蛋白)等。③鹽生植物獨特的運輸方式：通過細胞內的隔離將有毒害的離子經主動運輸方式在不接觸細胞質的情況下運輸到液泡中，再通過囊泡將積累的鹽離子排出，同時質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(SOS1)和液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白(NHX1)表達豐度顯著上調，使Na+在鹽腺積累后向液泡區域化，促進鹽腺對Na+的分泌[56]，增強鹽生植物耐鹽性，還可以通過有效調控離子轉運、ROS清除和滲透物質合成等相關蛋白表達來適應鹽脅迫。④響應鹽脅迫時調節范圍不同：鹽生植物通過全面調節光合作用、蛋白質的合成、物質運輸、信號轉導、細胞骨架重塑、離子轉運和區隔化、滲透平衡、脅迫防御等相關蛋白表達量來獲得相對較高的抗耐鹽能力[57]，而甜土植物是部分或局部調節。

3 問題與展望

應用蛋白質組學技術可以篩選出由鹽脅迫導致的植物體內差異蛋白質，通過解析其生物學功能，明確植物響應鹽脅迫的調控機制。蛋白質組學方法為揭示植物在鹽脅迫下特異蛋白質表達提供了線索，但是也有不足：①利用蛋白質組學篩選出響應鹽脅迫的差異蛋白質后，后續研究欠缺。②同一作物響應不同鹽類脅迫的調控機制有相同亦有不同之處，目前研究鹽脅迫的鹽類大多是NaCl，比較單一。③研究對象均為常見植物，種類有限，鹽生植物的種類研究力度不夠。

不同植物或同一植物的不同品種對同種鹽的耐鹽性會有所不同，產生不同的差異蛋白質，而這些差異蛋白質的正常表達往往是受某些基因的調控。因此，我們要利用蛋白質組學技術快速挖掘出鹽脅迫應答的差異蛋白質，獲得控制這些蛋白質的基因后，采用轉基因技術培育耐鹽性強的植物新品種。鹽生植物具有較強的耐鹽、抗鹽能力，應加強對鹽生植物適應抗鹽生理機制的研究分析，挖掘鹽生植物的經濟價值，促進鹽生植物作物化，找到提高甜土植物特別是設施栽培植物耐鹽能力的新途徑。