噬菌體治療細菌性疾病的研究進展及發展方向

鄒秀月，蔡德周

(大理護理職業學院微生物學教研室，云南 大理 671000)

噬菌體是寄生細菌、放線菌、真菌等微生物體內的病毒。噬菌體與宿主菌之間具有嚴格的特異性，其特異性取決于噬菌體吸附器官和受體菌表面受體的分子結構和互補性。噬菌體只有在活菌內才能增殖，在病毒中分布廣泛，通常有細菌存在的地方就可以找到噬菌體。

從2009年12月開始，國際學者相繼在世界各地發現一種攜帶NDM-1耐藥基因的新型“超級細菌”，這種細菌能夠對全球上市的近200種抗菌藥物產生耐藥性[1]。2010年10月中國疾病預防控制中心和中國軍事醫學科學院宣布中國寧夏和福建兩省發現攜帶有“超級細菌”的3例病例[2]。美國每年有200多萬例耐藥菌感染患者，直接導致23 000例患者死亡[3]。在日本，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢出率>30%[4]。據國家食品藥品監督管理局藥品審評中心的調查研究[5]顯示：多年來我國抗菌藥物臨床用量高居各類藥物之首，每年有20萬例死于藥物不良反應，其中因抗菌藥物濫用導致的死亡占40%。奧尼爾委員會(O’Neil commission)對消除抗菌藥物耐藥性全球威脅的手段進行了評估，預計至2050年，全球將有1 000萬例患者死于耐藥菌感染[3]。耐藥菌株越來越多，耐藥性越來越強，在這樣的醫療環境中，研究新的抗菌藥物及治療方案來對抗耐藥菌感染已成為全球亟待解決的問題。在G20杭州峰會上，抗菌藥物耐藥性問題已被提上議程。因噬菌體具有特殊的生物活性和強大的抗菌功能，重新進入了科學家的視野，科學家也開展了廣泛的試驗研究和臨床實踐。2014、2016年第一屆和第二屆噬菌體國際學術研討會相繼在南京、武漢召開，標志著全球開始重視噬菌體臨床治療。

1 噬菌體的特性

噬菌體分為毒性噬菌體和溫和噬菌體兩類。能在宿主菌體內增殖并導致宿主菌死亡的噬菌體稱為毒性噬菌體。毒性噬菌體復制產生子代噬菌體，當子代噬菌體達到一定數量時，由于噬菌體合成酶類的溶解，菌體細胞裂解，釋放出的噬菌體再感染其他敏感細菌，再度裂解細菌。溫和噬菌體是指感染宿主菌后并不增殖，其基因整合于細菌染色體上即前噬菌體，隨細菌染色體的復制而復制，并隨細菌分裂而分配至子代細菌的染色體中。帶有前噬菌體基因組的細菌稱為溶原性細菌，溫和噬菌體也可偶爾自發地或在某些理化或生物因素的影響下，將整合的前噬菌體脫離宿主菌染色體，進入溶菌性周期導致細菌裂解，并產生新的成熟噬菌體。

2 噬菌體治療技術的優勢

噬菌體是自然的產物，是微生物食物鏈中的一個環節。噬菌體可以侵染細菌，利用細菌新陳代謝自我復制，對細菌具有天然的裂解能力和與生俱來的適應優勢，這種噬菌體的裂解能力不受細菌耐藥性和生存環境的影響，是大自然一物降一物的杰作，使用噬菌體作為抗菌劑，符合自然規律和叢林法則。

抗菌藥物不易突破血腦屏障進入腦組織，噬菌體感染小鼠腦部并能原位增殖說明噬菌體可通過血腦屏障[6]。抗菌藥物的廣譜抗菌性，既能殺滅敏感的致病菌又能殺滅非致病菌，還能引起非敏感菌發生耐藥變異。長期使用將導致人體正常菌群紊亂，出現菌群失調，甚至導致機會感染。噬菌體特異性強，其特異性由噬菌體和菌體本身決定。一種噬菌體只侵染相應的細菌，并在細菌感染部位裂解該細菌，不會擴散，隨著宿主菌的裂解而死亡，不會單獨留存在體內，更不會繁殖。而且對哺乳類動物細胞無任何影響，不會影響人體的正常菌群。如果抗菌藥物對患者治療無效，那么噬菌體制劑替代抗菌藥物可能會有較好的治療效果[7]。

噬菌體在宿主菌體內繁殖速度快，在短時間內能復制出許多子代噬菌體。每個子代噬菌體與親代噬菌體具有相同的侵染、復制能力，通過多代增殖，少量噬菌體就可殺滅許多細菌。一次給藥，連續有效，直至消滅全部細菌[8]。噬菌體還可根據宿主菌的分裂速度調整復制速度和裂解能力，動態適應宿主菌。抗菌藥物若不能殺死細菌，將使細菌的耐藥性越來越嚴重。試驗證明細菌對噬菌體產生對抗的突變頻率為10-7，而細菌對抗菌藥物產生對抗的突變頻率為10-5[9]，因此，對于那些多重耐藥菌、泛耐藥菌甚至“超級細菌”感染，抗菌藥物的選擇非常有限，甚至無藥可選，在這種情況下，噬菌體治療將大有用武之地。

噬菌體存在自然界的各個角落，包括河水、土壤、污水中都存在。可以說，凡是有細菌的場所，就有相應噬菌體的存在，在健康人體的正常菌群中也廣泛存在[10]。在微生物生態環境中，噬菌體是細菌的克星，能殺死細菌并伴隨細菌的存在而存在，死亡而死亡。在人類尋找抗菌藥物、治療細菌性感染疾病中，噬菌體容易獲取，是取之不盡的自然資源[11]。篩選裂解耐藥菌株新噬菌體的周期短，有時僅需幾周或幾個月的時間。通過人工培養細菌、過濾除菌、純化噬菌體、制備高效價噬菌體即可獲得[12]。研發成本較低，制劑常溫保存即可。而開發一種新抗菌藥物則可能需要幾年甚至十幾年。Spellberg 等[13]對全球最大的15家跨國制藥公司調查后獲悉：目前只有5種抗菌藥物制劑處于研發階段。細菌耐藥變異發生的速度遠超過人類研發出新型抗菌藥物的速度，研究生產全新抗菌藥物勢在必行。

3 噬菌體臨床治療歷程

1915年英國科學家Edward Twort發現了噬菌體(bacteriophage)。1919年，加拿大科學家Felix D’Herelle用噬菌體制劑對4例細菌性痢疾患者進行治療，獲得成功。第一次證實噬菌體可作為藥物裂解細菌[14]。1921年Bruynoghe等最先使用噬菌體制劑治療皮膚葡萄球菌化膿性感染，病情在2 d內有所好轉[14]。1931年，D’Herelle和DEliava在印度初次使用噬菌體治療消化道烈性傳染病霍亂，噬菌體治療試驗組的病死率為6.8%，而對照組的病死率為62.7%[14]。二十世紀三十年代美國制藥公司開始銷售以噬菌體為基本成分的治療藥物。二十世紀六十年代，葡萄球菌噬菌體的溶菌液(SPL)被許可用于治療人類疾病[15]，應用噬菌體治療抗菌藥物治療失敗的600多例患者，80%的患者被治愈。治療過程中患者未出現副作用。第二次世界大戰期間德國和蘇聯軍隊用噬菌體治療腹瀉，取得很好效果。

進入二十世紀七十年代末期，Eliava研究中心使用葡萄球菌噬菌體制劑用于局部治療，效果顯著。僅采用噬菌體治療的膿毒癥患者中有41%的患者痊愈，采用噬菌體與抗菌藥物聯合使用治療的膿毒癥患者中有78%的患者被徹底治愈，而僅用抗菌藥物治療的膿毒癥患者中治愈率僅為23%。2009年英國皇家耳鼻喉專科醫院對噬菌體治療Ⅰ期和Ⅱ期慢性耳炎進行臨床研究[16]，安全性及效果均較好。噬菌體蛋白鼻腔噴霧劑還能有效預防中耳感染[17]。Weber-Dabrowska B等使用噬菌體治療腫瘤患者20例和細菌感染者27例，發現所有患者的肺炎及化膿性創傷感染等并發癥明顯好轉[18]。噬菌體可激活免疫應答，促進細胞因子的分泌，提高免疫。

噬菌體藥物在前蘇聯、波蘭及其他國家的醫院一直在廣泛使用，噬菌體雞尾酒療法已被成功應用數十年，普通藥店已有噬菌體藥物出售，包括噴霧劑、粉末劑、傷口貼、液體制劑等，有效的治療了傷口細菌感染。美國食品藥品監督管理局(FDA)批準使用噬菌體對多種細菌感染引起的下肢靜脈性潰瘍進行臨床試驗，治療效果好又安全[19]。化膿性腦膜炎和癤病治愈率甚至達到了100%。2016年，美國加利福利亞大學教授Thomas Patterson感染多重耐藥鮑曼不動桿菌而處于昏迷，使用鮑曼不動桿菌敏感的噬菌體雞尾酒及工程噬菌體治療，完全被治愈，轟動一時。

早在1958年，我國第一位細菌學博士余賀教授就利用噬菌體成功治療了1例銅綠假單胞菌感染的燒傷患者。抗美援朝時期，由于抗菌藥物極度匱乏，我國戰地醫院也曾利用噬菌體治療戰傷。據李宏鳴等[20]報道，3例確診為結核性口腔潰瘍患者涂抹分枝桿菌噬菌體軟膏后，在1周內開始好轉，半年后復查已完全恢復。成都生物制品研究所研究人員使用國內自行研制的多價痢疾噬菌體治療23例痢疾患者，總有效率達95.66%。解放軍第175醫院的一項研究也發現，將22例痢疾患者分為兩組，分別用多價噬菌體和黃連素治療，發現兩組之間的治愈率差別無統計學意義，而噬菌體治療組的復發率較黃連素組低。

2012年的噬菌體治療回顧性研究[21]表明，153例各種感染性疾病患者曾接受噬菌體治療，40%的患者獲得滿意的治療效果(根除病原菌)，6例患者因不良反應而停止治療，其他未發現安全隱患。目前抗菌噬菌體的研究大多針對耐藥性細菌，實驗對象多為動物，治療主要應用于局部治療。想要使噬菌體抗菌治療得到廣泛應用，需要加快噬菌體在臨床實踐中的應用研究。

4 噬菌體治療技術的劣勢

噬菌體伴隨細菌存在而存在，伴隨細菌裂解而死亡。噬菌體死亡后，其蛋白質成分在細菌感染部位殘留，這些成分作為抗原物質，可激發機體產生免疫應答。免疫應答產生的抗體可阻止噬菌體吸附于細菌表面，從而影響噬菌體在細菌內的復制，會降低裂解細菌的能力。此外，機體的天然免疫也會將噬菌體清除。

噬菌體攜帶一些毒素基因可能會給機體帶來不利影響，噬菌體在感染宿主菌時，基因組上編碼的遺傳信息在感染細菌過程中能夠表達，倘若噬菌體基因組上存在有毒素基因，噬菌體殺死細菌的同時可能會產生毒素，對人體有毒害作用，存在安全隱患[22]。在治療感染性疾病時，敏感的抗菌藥物用得越早，殺菌效果越好。而細菌內的噬菌體只有達到一定濃度時才開始增殖。噬菌體接種過早或劑量不當時，可能會在開始增殖之前就被免疫系統消滅[23]。因此，把握噬菌體的最佳接種時間和接種方式與劑量將成為實施噬菌體治療技術的難點。

噬菌體識別宿主菌時的高度特異性，決定了噬菌體的抗菌譜很窄。噬菌體的特異性不是表現在細菌的種水平，而是表現在型的水平[24]。某一型的噬菌體只能侵染并裂解相應型的細菌，對其他型的細菌不起作用，一定程度上限制了噬菌體在臨床上的廣泛應用。病原菌種屬多、型多，均需要研究得到相應的噬菌體。將多種噬菌體制成混合制劑，應用范圍才會擴大。如果將其他國家和地區研發的噬菌體產品應用于我國耐藥菌的控制，可能并不一定有效。

噬菌體治療技術幾乎都使用烈性噬菌體，目前因沒有足夠數量和種類的烈性噬菌體，使噬菌體治療技術不能在臨床治療中廣泛推行[25]。現在分離到的噬菌體多針對革蘭陰性菌，針對革蘭陽性菌的報道則比較少。

細菌與人類有廣泛的相互作用，而噬菌體與人類還沒有直接的關系。韓晗等[26]認為：由于病毒的本質，噬菌體常呈現出較為負面的公眾印象，始終遭受部分學者質疑，甚至日后可能面臨極大的公眾阻力。在治療人類疾病方面，噬菌體還未獲得大部分國家的授權和許可。在后抗菌藥物時代，噬菌體療法有望成為治療細菌感染的未來趨勢，但是受科技發展水平、法律法規的監管理念以及倫理和生物安全等因素制約，噬菌體治療依然面臨著諸多挑戰。

5 噬菌體治療發展方向

細菌遺傳學的創始人、諾貝爾獎獲得者Lederberg博士在美國科學院院報(PNAS)的評論中指出：因耐藥性細菌的出現，抗菌藥物治療感染性疾病不再像曾經的那么有效，應該重視噬菌體作為生物抗菌制劑的研究，各國政府必須高瞻遠矚、未雨綢繆，做好頂層設計[27]。

一個理想的可用于治療的噬菌體應具備強大的裂解能力，較好的環境適應性和穩定性，基因組上不攜帶毒素基因，具有相對廣譜的裂解范圍，至少應能裂解某個屬的絕大部分細菌，易于分離和純化，對人的免疫系統無負面影響等。

目前研究噬菌體的單位和學者逐漸增多，如果將各地區所有收集的噬菌體信息展示在一個共享平臺上，形成一個噬菌體庫，那么在需要某種噬菌體進行治療時，就可以實現快速資源共享。這可能是未來應對超級細菌或者恐怖襲擊等緊急狀況時一個恰當的選擇，是國家生物安全的一項保障措施[24]。

利用現代分子生物學技術，采用適當的基因改造策略，提取噬菌體中細胞壁裂解酶、噬菌體內溶素等有效成份作為抗菌藥物，這樣既可保持噬菌體殺菌活性，又不會引起免疫反應。研究[28]還發現，這些活性成份與其他抗菌制劑聯合使用可提高抗菌效果，對目標細菌產生協同治療效應。鄭旭東等[29]認為，活性成分非噬菌體本身的成分，不具有自我復制或基因整合能力，克服了噬菌體的免疫原性及微生物的耐藥性，排除了對人類自身構成的潛在威脅，極有可能成為全新作用機制的抗菌藥物。

噬菌體的作用譜比較窄，一定程度上限制了噬菌體在臨床上的應用。目前常見的解決方案是用噬菌體雞尾酒制劑來控制不同型別細菌的感染[30]。雞尾酒制劑內包含的噬菌體種類越多，其宿主譜覆蓋度就越大。另外一個方法是通過對已有噬菌體的改造，擴大其宿主范圍[31]。同時，利用連續傳代篩選出變異后能在體內長期循環的噬菌體，該噬菌體一定程度能抵抗機體免疫系統的清除，可延長在體內的生存時間。

專家提出將噬菌體作為藥物的運輸工具，將藥物運輸到目標菌體內發揮殺菌作用。方法一：將抗菌藥物直接連接到噬菌體上，借助噬菌體與宿主菌之間的特異性，將抗菌藥物引導至細菌感染處，提高抗菌藥物的局部濃度，從而殺滅耐受常規藥物劑量的目標細菌；方法二：利用生物技術，依靠噬菌體將外源致死性基因注入細菌內并表達為殺菌蛋白，由殺菌蛋白直接殺死細菌[32]。噬菌體作為藥物載體，既能提高細菌感染部位藥物的濃度，又能提高藥物的利用率，還能作為部分噬菌體殺菌活性不足的補充。因此，最理想的抗菌藥物就是藥物載體噬菌體。

此外，篩選有效的噬菌體劑型，建立科學的針對噬菌體制劑的藥學標準，純化噬菌體制劑，降低毒素水平，利用噬菌體與白細胞、抗菌藥物的協同作用，都是當前研究和發展的方向。

6 噬菌體抗體技術

免疫血清抗體和雜交瘤抗體都不是人源性抗體，生產量有限，而且有免疫原性。隨著基因工程技術的發展，出現了噬菌體展示技術。應用噬菌體展示技術對抗體進行表達和克隆，針對億萬種不同特異性抗體可變區的基因，組建噬菌體基因文庫，形成噬菌體抗體庫[33]。噬茵體抗體庫實現了不同特異性抗體的表達和基因型的統一，把抗原識別和抗體無限制生產能力結合在一起，在人源性抗體的獲得和篩選方面突顯其優勢[34]。噬茵體抗體庫技術是迄今發展最成熟、應用最廣泛的抗體制備技術。