前列腺增生組織細胞凋亡及bcl-2癌基因表達的作用與前瞻性研究

王海生 榮 陽 榮根滿

（1 遼寧省遼陽市中心醫院泌尿外科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫院醫務處，遼寧 遼陽 111000；3 中鐵十九局集團中心醫院醫務科，遼寧 遼陽 111000）

良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）是一種慢性、老年性、增生性疾病。就前列腺增生及其因素研究已有許多報道，但在增生組織中細胞凋亡和相關癌基因表達調控研究甚少。我們應用脫氧核苷酸末端轉移生物素標記脫氧尿嘧啶（terminal deoxynucleotidyl transferose -me-diated dutp-biotin nickend labeling，TUNEL）和mRNA原位分子雜交技術，檢測30例BPH組織病理中，細胞凋亡和bcl-2癌基因表達變化。從而分析細胞增殖、凋亡與癌基因的關系，了解不同組織病理類型的BPH的發展趨勢。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 對象：2016年1月至2017年12月行前列腺摘除術的BPH，選擇以彌漫性增生，無結節形成的30例BPH患者的前列腺增生組織標本。

1.1.2 主要試劑：寡核苷酸3′末端標記生物素探針試劑盒，地高辛標記檢測試劑盒。生物素堿性磷酸酶染色試劑盒，bcl-2質粒，限制性內切酶，瓊脂糖等（均購自sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本制備：將摘除的前列腺置于40%多聚甲醛緩沖液中16 h以上，脫水浸蠟，包埋，連續切片6～10 μm，貼附在黏附劑包被的載玻片上。

1.2.2 探針標記：將bcl-2質粒定量與限制性內切酶混合，37 ℃反應3 h，進行DNA瓊脂糖電泳，在長波紫外線下切除bcl-2DNA條帶，低溫離心，酚-氯仿提取，冷乙醇-20 ℃沉淀20 h，高速離心，棄上清，將沉淀溶解；置于100 ℃ 10 min，迅速置于冰浴3 min，加入六核苷酸引物，地高辛標記dNTP，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Kenow片段，37 ℃ 1 h，終止反應，在冷乙醇-20 ℃沉淀2 h，高速離心，棄上清干燥，再溶解備用[1]。

1.2.3 TUNEL技術：將6 μm的組織切片置于70 ℃烤10 min，脫蠟入水，在20 μg/mL蛋白酶K溶液中消化15 min，沖洗后覆蓋含有末端脫氧核苷酸轉移酶（TDT）0.3 U/μL、生物素化dUTP（bio-11-dUTP）1 mmol/L的TDT緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl PH7.2、140 mmol/L溴腫酸鈉、1 mmol/L氯化鈷）37 ℃ 1～2 h，終止反應，進入堿性磷酸酶顯色，3%牛血清白蛋白（BSA）封片，加鏈霉親和素-堿性磷酸酶連接物（SA-AP）1∶200，37 ℃1 h，沖洗，在四氮唑藍（NBT）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP）液中，室溫暗處顯色[2]。

1.2.4 mRNA原位分子雜交：將10 μm組織均片置于30 ℃干燥，脫蠟入水；浸入0.2 NHCl液20 min，入2×ssc（1000 mL液中含NaCl 175.3 g，檸檬酸鈉88.2g）50 ℃ 30 min，在3 μg/mL溶液中37 ℃消化15 min，分別浸入0.2%甘氨酸，0.25%乙酰酐和0.1 mol/L三乙醇胺，室溫各10 min，過梯度乙醇，空氣干燥；42 ℃預雜交2 h；42 ℃雜交16～19 h，2×ssc 40 ℃沖洗30 min×4，1×ssc 40 ℃15 min×2，0.1×ssc 40 ℃15 min×2；分別浸入緩沖液Ⅰ（150 mmol/L NaCl、0.1 mol/LTris-HCl pH 7.5）和30%BAS，室溫5～30 min，加蓋含有地高辛-AP（1∶500）緩沖液Ⅰ，37 ℃1.5 h，分別用緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ（0.1 mol/LTris-HCl pH 9.5，0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2、）浸洗，在NBT和BCIP緩沖液Ⅱ中顯色1～3 h，自來水沖洗，甲綠復染，封片[3]。

2 結 果

在光學顯微鏡下BPH的組織病理顯示，前列腺腺上皮細胞單層排列，間質增生。TUNEL方法檢測到的凋亡細胞分布在前列腺腺上皮細胞，大量的腺上皮細胞的細胞核染色質沿核膜凝集形成環狀或半月狀，核收縮呈深藍色著色，核質內空泡形成，間質無著色。mRNA原位分子雜交檢測bcl-2癌基因表達，在前列腺上皮細胞表達陰性，而增生的間質中bcl-2癌基因陽性表達，分布密集，呈深5藍色著色。

3 討 論

細胞動學過程包括細胞增殖，分化和死亡，三者之間的平衡才能維持某器官形態，大小和功能、維持這一過程的細胞死亡不同于細胞壞死，它是一個自然的生命結束，因此有它病理形態上的特征，共分三期，一期細胞核染色體DNA沿核膜凝集成新月狀或環狀。核和胞質收縮，二期以發芽形式將核和胞質混合分離成多種形態有包膜的凋亡小體；三期該小體被鄰近的吞噬細胞吞噬消化，不留任何痕跡。這種自然消失的細胞就象樹葉凋謝一樣，稱為細胞凋亡（Apoptosis），它的發展過程是受遺傳素質，各種細胞損傷性刺激改變了遺傳信息的轉錄和／或翻譯（如癌基因異常表達）形成死亡蛋白，后者能激活核酸內切酶，引起核染色體DNA凝集和斷裂，這標志著細胞凋亡開始。本研究觀察前列腺腺上皮細胞的細胞核變化符合細胞凋亡形態特征，表明BPH的組織增生類型不同，即以腺上皮細胞增生為主的BPH；和以間質增生為主，腺上皮細胞凋亡的BPH；從而推測BPH的組織增生類型的不同可能與病因不同有關，進一步了解不同的誘發因素，將給臨床非手術治療提供理論依據[4]。

在前列腺組織中，激素，細胞因子和各種癌基因形成一個調節網絡。當這個網絡發生改變后，就可能造成前列腺不同細胞增殖和／或凋亡異常，引起不同細胞總數增加，導致前列腺體積增大。BPH組織病理兩種類型中，腺體及導管上皮增生可能與雄激素降低無關，與其他因素有關，而間質增生可能與雌激素水平在間質中明顯高于腺上皮細胞以及其他因素有關。給予人類BPH芳香化酶抑制劑后，可使前列腺縮小，排尿梗阻癥狀改善。對狗去勢后，再置入睪丸劑，使縮小的前列腺恢復原狀，說明前列腺增生組織中有雄激素依賴的敏感細胞發生凋亡，這一點與本研究結果相符[5]。

目前最關注的研究是前列腺增生組織中癌基因與細胞增殖和凋亡的關系。其中最為關系密切的癌基因是bcl-2，它是從濾泡性淋巴瘤分離出來的一種癌基因，是在t（14、18）染色體易位斷點處發現的一種癌基因，其蛋白位于線粒體內膜。研究發現bcl-2癌基因抑制細胞凋亡，延長細胞壽命。在人類目－2蛋白表達僅局限在正常前列腺組織中基底細胞內。以腺體及導管增生為主的BPH，腺上皮細胞中bcl-2蛋白陽性表達率明顯增高。提示在雄性激素降低的情況下，維持前列腺增生組織腺上皮細胞壽命和增生并逃避細胞凋亡的原因很可能與bcl-2蛋白高表達有關。本研究發現前列腺增生組織腺上皮細胞bcl-2癌基因陰性表達，使大量的腺上皮細胞凋亡；而間質中的bcl-2癌基因強陽性表達，更進一步促進間質的增殖。從上述研究資料推測與前列腺癌前病變密切相關前列腺上皮內腫瘤（PIN）和非常典型性腺瘤樣增生的BPH[6]，很可能與腺上皮細胞內bcl-2蛋白表達有關。

BPH的不同組織病理類型，其細胞增殖和細胞凋亡表現不同。前列腺增生組織腺上皮細胞凋亡是存在的。腺上皮細胞的增殖和凋亡，以及間質的增殖，除與激素有一定關系外，更重要的是受bcl-2癌基因的調控。對bcl-2蛋白高表達的腺上皮細胞是否是前列腺癌前癌變的高發類型的BPH，還有待進一步研究。了解BPH不同組織類型和不同的引發因素，將為今后非手術治療BPH提供理論依據。