發酵牛肉調味基料在牛肉餅中的應用效果

樊曉盼，馬儷珍，劉一鳴，韓 蕓，李瀟瀟，施 煜,*

（1.天津農學院工程技術學院，天津 300384；2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384；3.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384）

傳統肉味調味基料通常是以動物性資源（肉或骨）為原料，經熱-壓浸提、酶法水解、美拉德熱反應及調配等工序制備而成，將其應用于肉制品中能起到調味增香的作用，目前市場上的肉味調味基料大致分為混合型、熱反應型和調理型三大類[1-3]。肉味調味基料出現后得到迅速發展，被廣泛用于加香產品中，其品質直接影響加香食品的風味和品質。隨著食品行業的蓬勃發展，肉味調味基料逐漸成為加香產品的競爭焦點[4]，學者們對肉味調味基料的研究主要集中于肉類風味體系的建立、香氣成分的分離、提取及其功效研究（抗氧化作用、增香作用、乳化作用、穩定作用及與蛋白質交聯作用等）[5-6]。齊景凱等[7]對自制牛骨肉味香精清除2,2'-聯氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基（ABTS+·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·和·OH的活性及其抗氧化性進行研究，發現牛骨肉味香精對4 種自由基均有清除作用，且在ABTS體系中的抗氧化能力最強。丁小強等[8]發現，魚蛋白酶解液底物經美拉德熱反應后，抗氧化能力大大提高，可以作為一種具備優良抗氧化性能的食品添加劑。

微生物在代謝過程中會產生風味物質[9]，目前，已有一些學者報道了發酵型肉味調味基料的制備工藝。李松耀等[10]利用霉菌孢子和耐鹽酵母的發酵研究出一種發酵制備肉味調味基料的方法，原料肉經蒸煮滅菌后接種霉菌孢子，利用霉菌代謝過程中產生的酶對物料進行酶解，從而產生特殊的發酵香氣；向所得固體發酵物中接種耐鹽酵母進行二次發酵，進一步分解物料并加強其香味特征；在此基礎上添加蛋白酶進一步酶解，在所得酶解液中添加氨基酸和還原糖等，經美拉德反應制得發酵型肉味調味基料。魏欣等[11]在酶水解和美拉德反應的基礎上，研制出利用純種發酵或半發酵結合酶水解和美拉德熱反應制備肉味調味基料的方法，接種發酵菌對原料肉進行發酵，并選擇合適的因素水平優化發酵條件，制備出的產品肉香四溢。已有研究證明肉味調味基料用于肉制品中可以起到調味、增香、抑菌及抗氧化等作用[12-14]，而經過發酵后的調味基料又具有促進發色的作用[15]，這正是肉制品加工中亞硝酸鹽的作用之一，但目前尚未有學者進行系統研究來證明其替代亞硝酸鹽的可行性。

本研究所用的發酵牛肉調味基料（fermented beef flavor，FBF）是以牛骨肉末為原料，經熱-壓浸提、酶解、發酵和美拉德反應制備而成，前期檢測發現FBF本身具有特殊風味[16]，將其加入牛肉餅中具有發色、增香的功能，同時還具有抑菌、抗氧化等作用。在牛肉餅中添加不同比例FBF，以添加NaNO2作為陽性對照組，不添加NaNO2作為陰性對照組，對牛肉餅進行感官評價，并測定產品貯藏過程中的理化指標（紅度值（a*）、pH值、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值及亞硝酸鹽殘留量），考察FBF在牛肉餅中的應用效果，從而評估其替代或部分替代亞硝酸鹽的可行性，為實際生產提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨肉末（冷凍牛胴體電鋸分割時留下的肉末，骨肉比3∶7，m/m） 天津掛月食品有限公司；新鮮牛前肩肉、食鹽、白砂糖、玉米淀粉、雞精、花椒粒、大紅椒、黑胡椒粉、桂皮粉、花椒粉、五香粉、丁香粉、鮮味汁、料酒、香油、葵花籽油、鮮姜末、鮮蔥末、雞蛋等 天津市紅旗農貿市場。

風味蛋白酶（500 LAPU/g）、蛋白酶（1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌） 意大利薩科公司；復合磷酸鹽 青島食宴大廚房食品有限公司；抗壞血酸鈉 鄭州食全食美商貿有限公司；亞硝酸鈉 廣州馨之味食品配料商城；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、三氯甲烷、氯化鉀、鹽酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸及鹽酸奈乙二胺 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CM-5色差儀 日本Konica Minolta公司；BS 224s電子天平 塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；SX-500高溫高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；ST40R高速冷凍離心機 德國Theromo Scientific公司；FA-25勻漿機上海弗洛克液體機械制造有限公司；UV-180紫外分光光度計 日本島津公司；Starter 3100酸度計 美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FBF的制備

參考本實驗室前期研究[16]制備FBF。

1.3.2 實驗設計

表 1 實驗分組設計Table 1 Experimental grouping and design

以牛前肩肉為原料制作牛肉餅，實驗共設置10 組，具體分組設計如表1所示。以不添加任何腌制劑為陰性對照（negative control，NC）組，以添加不同比例亞硝酸鹽為陽性對照（positive control，PC）組，以添加不同比例FBF或0.05 g/kg NaNO2與不同比例FBF復配為實驗組。

按照表1的分組及設計配制好肉餡，攪拌均勻后于4 ℃條件下腌制12 h，將肉餡放置于模具成型后油煎制成牛肉餅，無菌環境下冷卻包裝，貯藏于20 ℃條件下。對新鮮產品進行感官評定，并在貯藏1、3、5、7 d時測定其a*、pH值、TBARs值和亞硝酸鹽殘留量。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 感官評價

由10 名經過專門培訓的食品專業人員組成感官評定小組（男女各5 人）。所有評定人員在進行感官評定前要在感官評定區待1 h以適應環境，在進行口感評定時，評價員在對每個樣品進行評價前要用清水漱口，以減小樣品之間的相互影響。牛肉餅的感官評定具體評分標準[17]如表2所示。

表 2 牛肉餅感官評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of beef patties

1.3.3.2 a*測定

將牛肉餅切去表皮后切成長條狀，用保鮮膜包裹1 層，色差儀經校正后測定樣品正反兩面的a*，多次測量取平均值[18]。

1.3.3.3 亞硝酸鹽殘留量測定

參照GB/T 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[19]。

1.3.3.4 TBARs值測定

參考John等[20]的方法，并做適當修改。取1.00 g絞碎肉樣放入10 mL離心管中，加入5 mL儲備液（含有0.375%硫代巴比妥酸和15%三氯乙酸的0.25 mol/L鹽酸），沸水浴10 min；冷卻后加入1 mL氯仿，放入高速冷凍離心機中離心，取上清液測定吸光度。

1.3.3.5 pH值測定

參照GB 5009. 237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[21]。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2003軟件計算各指標的平均值和標準差，用Statistix 8.1軟件中的Turkey test程序對數據的差異顯著性（P＜0.05）進行分析，用Sigmaplot 10.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 牛肉餅的感官評價結果

表 3 10 組牛肉餅的感官評價結果Table 3 Sensory evaluation of 10 groups of beef patties

由表3可知：NC組牛肉餅的各項感官指標評分均明顯低于其他9 組；對比NC組與PC、FBF、PC-FBF組可以看出，牛肉餅的口感、色澤、滋味和氣味4 項評分隨著NaNO2或FBF的添加量的增加而升高，而產品之間的質地差異不大，表明NaNO2和FBF用于牛肉餅中均能起到改善色澤、提高風味的作用，但對牛肉餅的質地無顯著影響。NC組牛肉餅的色澤分值遠低于PC組（P＜0.05），這是由于亞硝酸鹽在肉制品中具有發色作用[22]，因此PC組的牛肉餅色澤鮮艷；FBF組牛肉餅的口感明顯優于NC組，說明FBF的添加能夠增強產品風味，添加不同比例的FBF為牛肉餅增添了特殊的風味，使得牛肉餅口感更加爽口細膩。與NC組相比，PC-FBF組牛肉餅的口感、色澤、滋味和氣味評分均有明顯提高，其中口感和色澤評分差別最大（P＜0.05），說明亞硝酸鹽和FBF同時發揮功效，使得牛肉餅的色澤和風味都得到明顯增強。對牛肉餅進行感官評價的結果表明，FBF對肉制品具有提色、增香的作用，且NaNO2-FBF復配使用（PC-FBF組）會使牛肉餅的感官評分更高，添加0.05 g/kg亞硝酸鹽+40 g/kg FBF時效果最佳。

2.2 牛肉餅貯藏過程中a*的變化

表 4 10 組牛肉餅貯藏過程中a*的變化Table 4 Changes in a* during storage of 10 groups of beef patties

由表4可知，貯藏期間NC組牛肉餅的a*顯著低于其余3 組（PC、FBF和PC-FBF組）（P＜0.05），而PC、FBF和PC-FBF 3 組之間無顯著性差異，a*均處于9.20～15.63之間。PC組牛肉餅由于添加了亞硝酸鹽，a*明顯上升，這是由于亞硝酸鹽具有發色作用，酸性條件下，亞硝酸鹽轉變成亞硝酸，亞硝酸不穩定，常溫下分解成亞硝基，亞硝基與肉中的肌紅蛋白和血紅蛋白結合生成穩定的亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白，使肉制品呈現鮮艷的紅色[23-25]。添加FBF的牛肉餅a*顯著高于NC組（P＜0.05），略低于PC組，這是由于FBF是以牛骨肉末為原料經微生物發酵制備而成的，乳酸菌、葡萄球菌等在沒有亞硝酸鹽的環境下，能夠使高鐵肌紅蛋白轉變成亞硝基肌紅蛋白，起到發色作用[26-27]。NaNO2-FBF復配后應用于牛肉餅中（PC-FBF組），產品的a*均與PC組差異不顯著，說明添加FBF能夠起到與NaNO2相當的發色效果。

2.3 牛肉餅貯藏過程中pH值的變化

表 5 10 組牛肉餅貯藏過程中pH值的變化Table 5 Changes in pH value during storage of 10 groups of beef patties

由表5可知，10 組牛肉餅貯藏過程中的pH值變化不大，處于6.06～6.48之間。隨著貯藏時間的延長，牛肉餅的pH值整體呈上升趨勢，這是由于隨著貯藏時間的延長，肌肉蛋白會在微生物代謝物和內源酶的作用下降解為多肽和氨基酸，釋放堿性基團，使pH值升高。本實驗室前期研究FBF時發現，在牛肉餅中添加FBF超過50 g/kg時，會導致pH值降低，低pH值則會加劇蛋白質的變性，使產品口感粗糙[28]。本研究中FBF的添加量在20～40 g/kg之間，根據pH值測定結果分析得知，在貯藏期內，添加40 g/kg FBF的牛肉餅pH值變化幅度最小，是牛肉餅加工中較合適的腌制劑添加量。

2.4 牛肉餅貯藏過程中TBARs值的變化

TBARs值是評價肉制品脂肪氧化程度的一個重要指標，TBARs值與脂肪氧化程度呈正相關，脂肪氧化會產生酸、醛、酮等物質，加劇酸敗程度，脂肪氧化程度增加還會產生自由基，破壞肉制品中的色素，從而導致肉制品品質下降[29-30]。

表 6 10 組牛肉餅貯藏過程中TBARs值的變化Table 6 Changes in TBARs value during storage of 10 groups of beef patties mg/kg

由表6可知，10 組牛肉餅的TBARs值隨著貯藏時間的延長整體呈上升趨勢。PC組牛肉餅的TBARs值始終較低，這是由于亞硝酸鹽具有抗氧化性；FBF組牛肉餅的TBARs值雖高于PC組，但始終低于NC組，說明本研究添加的FBF也具有一定的抗氧化性。此外，并非FBF的添加量越高，其抗氧化能力越強，FBFH組的TBARs值有時反而高于FBFM組，這可能是由于FBF本身含有一定量的脂肪（2%），在牛肉餅貯藏過程中，FBF自身的脂肪發生氧化，使得TBARs值增大。在接下來的研究中，可以考慮將FBF中的脂肪去除，避免其自身氧化導致的產品變質。

2.5 牛肉餅貯藏過程中亞硝酸鹽殘留量的變化

由表7可知，牛肉餅貯藏過程中的亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，說明亞硝酸鹽被用于促進牛肉餅發色、抑菌及抗氧化等過程。PC組和PC-FBF組牛肉餅貯藏0～3 d的亞硝酸鹽殘留量始終高于國家限定標準（30 mg/kg），說明產品貯藏初期，亞硝酸鹽尚未完全發揮作用，直到第5天時，低劑量的亞硝酸鹽組（PC1組）和PC-FBF組才達標，這就大大降低了產品的安全性。FBF組牛肉餅的亞硝酸鹽殘留量在貯藏第1天時為23.98～35.76 mg/kg，且之后始終低于PC組；貯藏第7天時，FBF組牛肉餅中的亞硝酸鹽殘留量為2.71～3.72 mg/kg，接近NC組（2.45 mg/kg），遠遠低于PC組。僅添加亞硝酸鹽的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量的下降趨勢較緩慢，而同時添加亞硝酸鹽和FBF的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量在第5天呈急劇下降趨勢，說明FBF會促進亞硝酸鹽發揮功效，從而避免牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量超標。從牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量這一指標分析，只添加FBF的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量最低，不同FBF添加量的作用效果差異不明顯。

表 7 10 組牛肉餅貯藏過程中亞硝酸鹽殘留量的變化Table 7 Changes in nitrite residue during storage of 10 groups of beef patties mg/kg

3 結 論

不同添加量的FBF及FBF-NaNO2復配對牛肉餅的色澤、風味、脂肪氧化程度和亞硝酸鹽殘留量均有一定影響。FBF的添加能顯著增強牛肉餅的風味，添加量越大，風味評分越高；不同比例FBF復配0.05 g/kg NaNO2均比單獨添加0.05 g/kg NaNO2制成的牛肉餅風味評分高；添加FBF可起到發色的作用，且發色效果能夠達到與添加0.10 g/kg亞硝酸鹽相當的水平；與亞硝酸鹽相比，只添加FBF的產品亞硝酸鹽殘留量低，產品安全性較高。綜合考慮各組產品的色澤、口感、抗氧化效果及亞硝酸鹽殘留情況，將20 g/kg FBF和0.05 g/kg NaNO2復配后添加到牛肉餅中進行加工，制得的產品色澤誘人、風味獨特且安全性較高，將其應用于肉制品中替代部分亞硝酸鹽具有廣闊的市場前景。