外源自毒物質對苜蓿、小麥生長發育的影響

鄭 瑞,師尚禮，馬史琛

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

自毒作用是指植物通過莖葉淋溶揮發、根系分泌釋放、殘茬腐爛分解等途徑產生某些物質，并對同種植物的生長產生抑制作用的現象[1]。這些物質在土壤中累積到一定濃度后，對植株的生長發育特別是對根系的發育及功能有一定的影響[2]。苜蓿(Medicagosativa)是中國乃至全世界最為重要的飼料之一，不僅填補了優質蛋白飼料的空缺，而且對優良奶產品、肉制品的發展和經濟效益做出了貢獻[3]。自毒作用是苜蓿連作后出苗率低、生長狀況變差、產量降低、品質變劣現象發生的主要原因[4]，目前被證實的苜蓿主要自毒物質有：萜類；類黃酮、異黃酮；苜蓿素、香豆素、生物堿、肉桂酸等[5]。小麥(Triticumaestivum)是通過根系分泌及殘體分解有毒物質的方式影響自身或其他植物生長發育的他感性禾本科作物，常作為苜蓿后茬作物進行輪作。小麥中被發現的酚酸類他感物質主要有阿魏酸(ferulic acid)、香草酸(vanillic acid) 、丁香酸(syringic acid) 、對羥基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid) 和對香豆酸(p-coumaric acid) 等[7]。

趙瑞林[8]研究發現，外源羥基苯甲酸對小麥種子萌發具有低促高抑的濃度效應。Abenavoli等[9]發現，香豆素使硬質小麥對硝酸鹽的吸收減弱[9]。在小麥的葉片、根系和根際土壤中均檢測到羥基苯甲酸、肉桂酸等抑制小麥生長的物質[10]。Abdul等[11]研究發現，在苜蓿的根系和殘茬中均存在酚酸類自毒物質。肉桂酸也是酚酸類物質之一，有研究報道，外源肉桂酸對豌豆的種子萌發和幼苗生長抑制作用顯著[12]。苜蓿素(Tricin)，又稱小麥黃素，廣泛存在于各種谷物中[13]。目前已從紫花苜蓿[14]、豌豆(Pisumsativum)[15]、小麥[15]、金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)[17]、玉米苞葉[18]等作物中檢測到苜蓿素的存在，但苜蓿素對作物生長發育的影響研究較少。香豆素也是典型的自毒物質之一，有研究發現香豆素濃度為0.1 g/L時對黑麥草、水稻的生長發育抑制明顯[14]。外源自毒物質對不同作物的影響已有較多報道，但對不同作物的影響效果差異還缺少相應的研究和佐證。Hedge[21]發現苜蓿自毒物質香豆素和肉桂酸在處理濃度高于6 ug/mL后，抑制作用顯著。陳靜[22]研究發現苯甲酸與4-羥基苯甲酸處理濃度為6.0 mg/L時對牡丹試管苗的生根具有抑制作用。鑒于此，試驗選用肉桂酸、羥基本甲酸、香豆素、苜蓿素4種外源自毒物質的不同濃度處理下對苜蓿和小麥生長發育的影響，比較其毒性強弱，為苜蓿和小麥連作、輪作提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用甘農2號紫花苜蓿、隴春BJ103小麥作為試驗材料，供試種子來自甘肅農業大學草業學院，肉桂酸、羥基苯甲酸、香豆素和苜蓿素4種外源自毒物質購買于武漢天植生物技術有限公司，分析純≥99%，并分別編號為：A、B、C、D。

1.2 試驗方法

1.2.1 澆灌液制備 準確稱取A物質0.005 g溶于100 mL蒸餾水中作為母液，將母液平均分為4份，第1份不加蒸餾水，標為濃度0.050 g/L的澆灌液，第2份加蒸餾水25 mL，標為濃度0.025 g/L的澆灌液，第3份加蒸餾水50 mL，為濃度0.010 g/L的澆灌液，第4份加蒸餾水125 mL，為濃度0.005 g/L的澆灌液。用同樣的方法制備B、C、D不同濃度的澆灌液。

1.2.2 種子萌發試驗 選取形態良好、外觀相似的苜蓿和小麥種子置于培養皿中，加0.05%的次氯酸鈉溶液消毒，15 min后用鑷子將種子取出，用蒸餾水將種子上的次氯酸鈉完全沖洗干凈，采用培養皿濾紙發芽試驗法，在培養皿中鋪平濾紙并用少量的蒸餾水浸濕，使培養皿底部與濾紙貼合完全。每個培養皿放置苜蓿種子30粒，小麥種子20粒，用不同濃度的澆灌液將種子完全浸沒，每個濃度做3次重復，蒸餾水浸沒作為對照。培養皿加蓋后放置于24℃，14 h光照10 h黑暗的光照培養箱中培養。每隔1 d添加澆灌液1 mL，以保證種子發芽的濕潤環境。起初每24 h計數種子萌發個數，連續3 d，72 h后測定發芽率，120 h后測定下胚軸長度、胚根及胚芽鞘的長度并計算相應的化感指數。

1.2.3 幼苗生長試驗 采用沙培法將消毒后的苜蓿、小麥的種子分別種于塑料杯中，定期澆灌不同濃度處理的澆灌液10 mL，以蒸餾水為對照，每處理3個重復，常規方法管理。30 d后選取長勢一致的苜蓿幼苗30株，小麥20株。測定幼苗苗高、根長、苗鮮重、根鮮重。計算化感效應指數(RI)。

RI=1-C/T(T≥C)

RI=T/C-1(T

式中：C為對照值，T為處理值。當RI>0時，表示促進作用，當RI<0 時，表示抑制作用：RI絕對值的大小代表化感作用強度。

1.2.4 根系活力測定 采用文獻[23]的方法測定苜蓿、小麥幼苗根系活力。

1.2.5 數據分析 采用Excel 2010整理試驗數據，采用IBM SPSS Statistics 19.0進行數據處理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同外源自毒物質不同濃度處理對苜蓿、小麥種子發芽指數的影響

A濃度為0.005 g/L時，苜蓿和小麥的種子發芽指數與CK差異不顯著(P<0.05)，濃度為0.010，0.025和0.050 g/L時，苜蓿種子發芽指數分別較CK降低18.92%，28.36%，43.23%；小麥種子發芽指數分別低于CK 11.81%，22.56%和40.31%(P>0.05)，A對小麥發芽指數的抑制強度較苜蓿略小。B濃度為0.005 g/L時，苜蓿發芽指數與CK無明顯差異(P>0.05)，濃度為0.010，0.025 g/L和0.050 g/L時分別較CK降低12.75%，19.21%和40.5%(P>0.05)；小麥發芽指數只有在最大處理濃度0.050 g/L時低于CK 21.82%，其他濃度作用下均與CK無顯著差異(P<0.05)。苜蓿種子發芽指數隨著C處理濃度增加而分別較CK降低20%、46%、78%、93%(P>0.05)；小麥發芽指數在C處理濃度為0.005 g/L時無明顯變化，濃度為0.010，0.025和0.050 g/L時分別低于CK 25%，36%和50%(P>0.05)。D濃度為0.005 g/L時，苜蓿種子發芽指數與對照差異不顯著(P<0.05)，濃度為0.010，0.025和0.050 g/L時分別較CK降低22.72%，50.59%和60.66%(P>0.05);小麥發芽指數在D濃度為0.005、0.010 g/L時與CK差異不顯著(P<0.05)，濃度為0.025、0.050 g/L時分別較CK降低20%、34%(P>0.05)(圖1)。

綜和分析，A、B、C、D對苜蓿、小麥發芽指數的毒性強弱表現為C>D>A>B，苜蓿發芽指數隨著C處理濃度增加而降低，而A、B、D只有處理濃度大于0.005 g/L之后，才對苜蓿發芽指數有抑制；A、C處理濃度大于0.010 g/L，小麥發芽指數隨著A、C處理濃度增加而下降，D處理濃度大于0.025 g/L后小麥發芽指數呈降低趨勢，B濃度為0.050 g/L時小麥發芽指數有降低。

圖1 澆灌液濃度處理的苜蓿、小麥種子發芽指數Fig.1 Germination index of alfalfa and wheat seeds treated with irrigation solution

2.2 對苜蓿、小麥種子萌發的影響

2.2.1 對苜蓿發芽率、胚根、下胚軸及胚芽鞘的影響 A、B濃度為0.005 g/L時，苜蓿發芽率和胚根長與CK差異不顯著(P<0.05)，下胚軸長低于CK 15%、12%(P>0.05)，A、B濃度為0.010，0.025和0.050 g/L時，苜蓿發芽率、胚根長和下胚軸長隨濃度增加而明顯降低，發芽率分別低于CK 14%，31%，38%；14%，18%和25%，胚根長分別低于CK 21%，39%，64%；15%，33%，56%，下胚軸長分別低于CK 35%，46%，60%；28%，41%，51%(P>0.05)。C、D不同濃度處理后，苜蓿發芽率、胚根長和下胚軸長隨濃度增加呈降低趨勢，苜蓿發芽率分別低于CK1 1%，32%和47%，54%；11%，21%，33%，48%，胚根長分別低于CK 24%、45%、65%、74%；16%、31%、48%、69%，下胚軸長分別低于CK 37%、51%、61%、75%；22%、40%、52%、67%(P>0.05)(表1)。

2.2.2 對小麥發芽率、胚根、下胚軸及胚芽鞘長的影響 A處理濃度0.005、0.010 g/L時，小麥發芽率、胚根長及胚芽鞘長與CK間無顯著差異(P<0.05)；濃度為0.025、0.050 g/L時，小麥發芽率、胚根長及胚芽鞘長分別低于CK16%、25%；28%、40%；15%、30%(P>0.05)。B處理濃度0.005，0.010和0.025 g/L時，小麥發芽率、胚根長和胚芽鞘長與CK間差異不顯著(P<0.05)，濃度為0.05 g/L時，小麥的發芽率、胚根長及胚芽鞘長分別低于CK 17%，24%，12%(P>0.05)。C的處理濃度為0.005，0.010，0.025、0.050 g/L時，小麥種子的發芽率、胚根長和胚芽鞘長分別顯著低于CK 16%、25%、38%、51%；23%、32%、46%、53%；11%、22%、35%、46%(P>0.05)，可見C對小麥根系的毒害抑制較芽更強烈。D處理濃度0.005 g/L時，小麥發芽率、胚根長及胚芽鞘長與CK間無顯著差異(P<0.05)，0.01，0.025和0.05 g/L處理后分別低于CK 11%，18%和27%；12%，33%和51%；11%，15%和26%(P>0.05)(表2)。

表1 澆灌液濃度處理下苜蓿的發芽率，胚根長、下胚軸長及化感指數Table 1 Germination percentage (%) of alfalfa treated with watering solution concentration,radicle length (cm),hypocotyl length (cm)

表2 澆灌液處理下小麥的發芽率、胚根長、胚芽鞘長及化感指數Table 2 Wheat germination rate (%),radicle length (cm),coleoptile length (cm)

結果表明苜蓿種子萌發隨自毒物質處理濃度的增加而受抑制作用增強；小麥種子萌發在自毒物質C的作用下隨C處理濃度的增加而受抑制作用增強，B在最大處理濃度時才對小麥種子萌發表現出抑制作用，A處理濃度超過0.010 g/L、D處理濃度超過0.005 g/L之后抑制小麥種子萌發。A、B、C、D對苜蓿、小麥種子萌發的毒性強弱均表現為C>D>A>B。

2.2.3 苜蓿、小麥種子萌發各指標化感指數絕對值 化感指數絕對值的大小表明化感強度，4種不同自素物質影響下，苜蓿、小麥種子萌發各指標基本均為負值(表1，2)。苜蓿種子萌發各指標化感指數絕對值均隨著自毒物質處理濃度升高而呈上升趨勢；小麥種子萌發各指標的化感指數絕對值在C各濃度作用下、A、D濃度大于0.010 g/L及B濃度大于0.025 g/L后迅速增大，說明抑制作用強度與自毒物質處理濃度關系密切。4種自毒物質毒性強弱表現為C最強，B最弱，A、D居中，且對苜蓿的抑制作用遠強于小麥(圖2)。

圖2 不同自毒物質在不同濃度時苜蓿、小麥種子萌發指標的化感指數絕對值Fig.2 The absolute value of allelopathic index of various indexes of alfalfa and wheat seed germination at different concentrations of different autotoxic substances

2.3 不同外源自毒物質不同濃度處理對苜蓿、小麥幼苗生長的影響

2.3.1 對苜蓿幼苗生長的影響 A 處理濃度為0.005 g/L時，苜蓿苗高和苗鮮重與CK間無顯著差異(P<0.05)，根長和根鮮重分別低于CK 21%、12%且差異顯著(P>0.05)，濃度為0.010，0.025和0.050 g/L時，苜蓿苗高、根長、苗鮮重、根鮮重隨之降低，說明A對苜蓿地下部的損害大于地上部；B處理濃度為0.005 g/L時苜蓿苗高、根長、苗鮮重、根鮮重與CK間無顯著差異(P<0.05)，0.010，0.025和0.050 g/L處理后呈降低趨勢，分別低于CK 13%、14%、11%、17%；18%、18%、11%、17%；37%、29%、17%、35%(P>0.05)。C處理濃度為0.005、0.010、0.025 g/L、0.050 g/L時，苜蓿苗高、根長、苗鮮重、根鮮重分別顯著低于CK 30%、38%、50%、63%；27%、36%、46%、56%；22%、40%、51%、67%；19%、37%、46%、63%(P>0.05)，D作用下分別顯著低于CK 19%、27%、37%、48%；21%、24%、29%、43%；17%、26%、39%、53%；14%、21%、29%、45%(P>0.05)，可見苜蓿幼苗生長各指標隨C、D處理濃度增加而明顯降低，且C處理下降幅度更大。

表3 澆灌液濃度處理下苜蓿的苗高、根長、苗鮮重及根鮮重Table 3 The height (cm),root length (cm),fresh weight (g),fresh weight (g) of Alfalfa

2.3.2 對小麥幼苗生長的影響 小麥的苗高、根長、苗鮮重、根鮮重在A濃度為0.005、0.010 g/L時與CK間均無顯著差異(P<0.05)，濃度為0.025、0.050 g/L時呈降低趨勢，分別低于CK 14%、22%；10%、18 %；13%、17%、15%、22%(P<0.05)；在B濃度為0.005，0.010，0.025 g/L時與CK間均無顯著差異(P<0.05)，0.050 g/L處理后分別顯著低于CK 16%，13%，11%和11%(P<0.05)；在C作用下隨著處理濃度的增加抑制效應增強，0.005、0.010、0.025、0.050 g/L處理后分別顯著低于CK 17%、25%、28%、32%；11%、15%、18%、27%；114%、18%、26%、32%；11%、16%、22%、31%(P<0.05)；D處理濃度0.005、0.010 g/L時與CK間均無顯著差異(P<0.05)，0.025、0.05 g/L處理后小麥的苗高、根長、苗鮮重、根鮮重分別顯著低于CK 17%、26%、10%、17%；17%、22%、15%、24%(P<0.05)。由此證明，在對小麥幼苗生長的影響中，C毒性最強，而A、D處理濃度大于0.010 g/L、B處理濃度為0.050 g/L時，才表現出明顯的抑制作用。

2.3.3 苜蓿、小麥幼苗生長各指標化感指數絕對值 4種自毒物質不同濃度處理下，苜蓿、小麥幼苗生長各指標化感指數均為負值，其絕對值越大說明化感抑制作用越強(表3，4)。苜蓿幼苗生長各指標化感指數的絕對值均隨著自毒物質處理濃度升高而呈上升趨勢，說明苜蓿幼苗生長受抑制程度逐漸增強；小麥幼苗生長各指標化感指數絕對值在C各處理濃度、A、D處理濃度大于0.010 g/L，B處理濃度大于0.025 g/L后明顯增大(圖3)。A、B、C、D 4種自毒物質對苜蓿、小麥幼苗生長的抑制強度表現為C最大，B最小，A、D居中，但對苜蓿、小麥幼苗生長的抑制程度有所不同，對小麥幼苗生長的抑制強度較苜蓿幅度輕緩。

圖3 不同自毒物質不同濃度時苜蓿、小麥幼苗生長的各指標化感指數絕對值Fig.3 The absolute value of allelopathic index of alfalfa and wheat seedling growth at different concentrations of different autotoxic substances

表4 澆灌液濃度處理下小麥的苗高、根長、苗鮮重及根鮮重Table 4 The height (cm),root length (cm),fresh weight (g),fresh weight (g) and of Wheat

2.4 不同自毒物質不同濃度處理時對苜蓿、小麥根系活力的影響

自毒物質對苜蓿根系活力的損傷大于小麥。0.005 g/L處理后，苜蓿根系活力在A、B作用下與CK差異不顯著(P<0.05)，在C、D作用下明顯低于CK 21%、17%(P>0.05)；0.010,0.025和0.050 g/L處理后，苜蓿根系活力在A、B、C、D作用下隨濃度增加而降低，其中C降低最多，分別顯著低于CK 33%，38%和47%(P>0.05)。小麥根系活力在A、B、D作用下，處理濃度超過0.010 g/L后，根系活力開始顯著降低；在C作用隨著處理濃度的增加而降低，0.005、0.010、0.025、0.050 g/L處理后，小麥根系活力分別顯著低于CK 11%、12%、15%、24%(P>0.05)。結果表明，在對苜蓿、小麥根系活力的影響，自毒物質毒性強弱表現為C>D>A>B，A、B、D只有處理濃度大于0.010 g/L之后才會對小麥的根系造成損害(圖4)。

3 討論

自毒作用普遍存在于豆科，禾本科以及其他作物中，連作障礙使農作物產量受損從而造成了很大的經濟損失。Miller D A[24]研究發現，苜蓿素能顯著降低苜蓿種子發芽率(降低59%)[24]。有研究發現經香豆素處理后，稗草(Echinochloacrusgalli)根的伸長顯著受抑制[25]。吳鳳芝等[26]研究發現羥基苯甲酸對黃瓜幼苗的生長有抑制作用，且隨處理濃度的增加而增強。曹光球等[27]研究發現肉桂酸對綠豆、大豆、黃瓜種子發芽表現為高濃度抑制萌發和生長，隨濃度的降低其抑制作用逐漸減弱，也有研究發現肉桂酸使小豆根系生長減弱、根系活力下降，從而導致小豆產量降低[28]。從發芽指數，化感指數及根系活力3個方面系統研究了肉桂酸、羥基苯甲酸、香豆素和苜蓿素對苜蓿、小麥生長發育的影響，結果顯示苜蓿發芽指數、種子萌發、幼苗生長及根系活力均隨著自毒物質處理濃度的增加而降低，自毒效應明顯，說明肉桂酸、羥基苯甲酸、香豆素和苜蓿素是造成苜蓿連作障礙的主要自毒物質；對小麥生長發育的影響中，香豆素對小麥發芽指數、種子萌發和幼苗生長及根系活力的抑制作用具有明顯的濃度效應，羥基苯甲酸、肉桂酸、苜蓿素在處理濃度大于0.010 g/L之后對小麥生長發育表現出抑制作用，但小麥總體受抑制程度遠小于苜蓿，說明4種自毒物質在苜蓿、小麥體內的含量不盡相同，研究發現[29-30]，苜蓿、小麥所含自毒物質的種類有所差異。這一結果為苜蓿、小麥連作障礙研究提供了一定實踐基礎。榮思川等[31]研究結果表明4-羥基苯甲酸、香豆素、綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、L-刀豆氨酸6種自毒物質對苜蓿的種子萌發和幼苗生長均有抑制作用。研究發現香豆素對多花黑麥草、稗草、萹蓄、紅三葉、紫花苜蓿、黃花草木樨等植物具有很強的抑制作用，但對不同植物的作用強度存在較大差異[32-33]。試驗結果表明，對苜蓿和小麥生長發育的抑制作用中，香豆素毒性最強；羥基苯甲酸毒性最弱；肉桂酸和苜蓿素毒性居中，4種自毒物質使苜蓿生長發育的受抑程度遠強于小麥，說明甘農2號苜蓿和隴春BJ103小麥自身都含有供試的4種自毒物質，苜蓿小麥輪作后，這些物質必將會形成積累，對后茬作物的生長造成不利影響，所以對輪作苜蓿、小麥品種的篩選尤為重要。

圖4 澆灌液濃度處理下苜蓿、小麥根系的活力Fig.4 Root activity of alfalfa and wheat seeds treated with irrigation solution

4 結論

肉桂酸、羥基苯甲酸、香豆素和苜蓿素對苜蓿生長發育的抑制作用強于小麥，苜蓿發芽指數、種子萌發、幼苗生長及根系活力隨著各物質處理濃度的增加而減少。

香豆素對小麥發芽指數、種子萌發、幼苗生長及根系活力有抑制作用，且隨處理濃度的增加而增強，肉桂酸、羥基苯甲酸和苜蓿素在處理濃度大于0.010 g/L之后抑制作用逐漸明顯。

4種自毒物質對苜蓿、小麥的抑制效應表現為香豆素毒性最強，羥基苯甲酸毒性最弱，肉桂酸和苜蓿素毒性居中，且對苜蓿的抑制作用較小麥更強烈。