復合菌劑對玉米根際土壤酶活性和微生物數量的影響

李海云，姚 拓，師尚禮，王國基，唐 玉，范宇航，胡鴻嬌，朱熙棟

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

玉米是世界上廣泛種植的三大糧食作物之一，同時也是畜牧業生產中不可或缺的青貯飼料來源之一，其種植面積僅次于小麥和水稻。截止2015年，我國玉米種植面積達3 811.9萬hm2，總產量22 463.2萬t，分別占糧食種植面積和總產量的33.6%、36.1%[1]。近年來，在玉米種植過程中出現因大量施用化肥引起種植環境(土壤、空氣、水源、微生物區系和多樣性)污染和產量降低等一系列問題[2]。研究表明在甘肅N、P是禾本科植物生長所必需的營養元素。氮、磷素養分的來源可以通過施用化肥，但由于化肥當季利用率較低，難以滿足作物對養分的吸收利用，為此現代農業在追求糧食高產和安全的前提下，在尋求一種既可以減少化肥施用量又能夠保證作物不減產和糧食安全的途徑。而微生物菌肥的施用則成為解決這一問題的有效途徑，也是發展環境友好型、低碳化農業的必然選擇[3-5]。研究發現施用微生物肥料替代部分化肥能使玉米不減產，還可以改善土壤微生境條件。黃鵬等[6]施70%～85%化肥+菌肥能夠使甘肅河西綠洲灌區玉米不減產，并且氮、磷肥利用率和光能利用率分別達到31.79%～32.20%，22.07%～22.31%和0.68%～0.71%，與不施肥相比85%化肥+菌肥顯著提高玉米收獲期的農藝性狀和產量，使株高、百粒質量、穗質量分別達358.32 cm，39.68 g，369.50 g，并使玉米的經濟產量提高21.6%；在微生物肥料替代15%化肥條件下，玉米地土壤微生物生物量碳、氮含量分別提高40.0%和18.5%，且在該處理下，土壤中細菌和放線菌數量顯著提高，分別達2.6×106cfu/g和1.4×106cfu/g[7]。土壤酶是土壤中重要催化物質之一，主要由微生物的細胞代謝產生，在土壤C、N、P、S循環中起著重要的催化作用；同時，它還是反應土壤微生物活性及土壤生化反應強度的指標，能表征土壤肥力、質量及其健康狀況[8-12]。在油菜種植中施用微生物菌肥后發現，油菜地土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量高于不施肥對照土壤，而且還能夠提高土壤磷酸酶及脲酶活性；尤其在中低磷素水平下，加入微生物菌肥有利于土壤磷素的可持續指數上升，但要穩定提高作物產量和土壤肥力，則必須配施一定量的化學肥料(如氮肥、鉀肥等)[13-17]。因此，利用從玉米根際土壤中分離的7株優良根際促生菌株作為供試菌株，制作復合微生物菌劑進行田間試驗，探究復合菌劑配施減量化肥對玉米根際土壤酶活及微生物數量的影響，以期篩選出適宜該地區的最佳施肥配比，為微生物菌劑的推廣應用提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 研究區概況

研究地位于甘肅省武威市涼州區黃羊鎮農墾農場甘肅農業大學牧草試驗站，地理位置N 37°52′20″，E 102°50′50″。地處甘肅河西走廊東端，屬典型內陸荒漠氣候區，海拔1 581 m；全年平均無霜期156 d，降水量164.4 mm，蒸發量1 919 mm，年均氣溫7.8℃，日照時數2 968.2 h，≥10℃年積溫2 985.4℃；年太陽輻射總量504～630 kJ/cm2。供試土壤為灌漠土，耕層有機質15.71 g/kg、全氮0.87 g/kg、全磷1.02 g/kg、速效磷13.38 mg/kg、速效鉀248.63 mg/kg，土壤pH8.2。

1.2 材料

供試玉米品種為金穗4號(Zeamayscv.Jinsui No.4)和先玉335(Z.mayscv.Xianyu 335)；供試化肥為磷酸二銨[總養分≧64%(N∶P2O5∶K2O=18∶46∶0)]和尿素(總氮含量≧46.4%)；供試載體配方參照段淇斌等[18]的方法；供試菌株為課題組分離自玉米根際的促生菌株P2-1，P4-4，P4-12，P4-15，P4-17，4N4和2N2，供試菌株信息見表1。

1.3 復合菌劑制作

菌株間的拮抗試驗采用蔣永梅[19]的方法進行測試發現各菌株間均無拮抗反應。將7株優良促生菌株分別接種在LB液體培養基，28℃，150 r/min培養72 h。待菌株充分生長后，利用分光光度計測定各菌株懸浮液D(660nm)值，用無菌水調其D(660nm)>0.5(即菌株懸浮液108cell/mL)，并將調好的各菌株懸浮液按特定體積比混合后備用；稱取載體250 g，121℃滅菌30 min，待載體冷卻后，接種混合菌株懸浮液，置于28℃培養箱中培養7～10 d，備用。

表1 供試菌株促生特性Table 1 Growth-promoting characteristics of tested strains

注：*表示待鑒定，“-”表示無，“+++”表示生長速度較快

1.4 試驗設計

試驗共設5個處理，處理A：全量化肥(純氮450 kg/hm2，磷素(P2O5)225 kg/hm2，當地土壤是富鉀土壤，故不施鉀肥)；處理B：85%化肥+復合菌劑；處理C：70%化肥+復合菌劑；處理D：復合菌劑(7.5 kg/hm2)；處理E：對照(不施肥)；每處理3個重復，2個玉米品種共30個小區，采用隨機區組設計，每小區面積45 m2，行株距為40 cm×30 cm，密度為7.5萬株/hm2。在2013年4月進行播種，播種前將種子(未包衣玉米種子)用菌肥拌種，置于陰涼、避光處0.5 h，對照處理種子用無菌水拌種。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 根際土采集 在2013年5月(苗期)、7月(抽雄期)、8月(灌漿期)和9月(成熟期)采用5點法采集玉米根際0～25 cm土樣，每個處理3個重復，將相同重復處理土樣均勻混合后分成2份裝入無菌塑料袋中，低溫迅速帶回實驗室。1份土樣進行土壤酶活性的測定，另1份新鮮土樣迅速進行3大土壤微生物數量計數。

1.5.2 土壤酶活性測定土壤酶活性采用常規方法進行測定[20]。土壤過氧化氫酶活性測定采用容量法測定，土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定，土壤堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，土壤蔗糖酶測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法。

1.5.3 土壤微生物數量測定土壤3大微生物數量測定采用平板稀釋計數法，細菌數量測定采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，真菌數量測定采用馬丁-孟加拉紅培養基，放線菌數量測定采用改良高氏一號培養基，微生物數量計算參照文獻[21]的方法。

1.6 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，多重比較采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 復合菌劑對玉米根際土壤酶活性的影響

2.1.1 復合菌劑對玉米根際土壤過氧化氫酶活性的影響 在2個玉米品種根際土壤中，土壤過氧化氫酶活性在玉米生育期呈現出先增高后降低的趨勢，在灌漿期，過氧化氫酶活性達最大值，并且土壤過氧化氫酶活性呈現出金穗4號>先玉335(除苗期外)(圖1)。土壤過氧化氫酶在玉米苗期不同施肥處理下表現為：處理A>B>C>D>E，其中，B和C相比對照分別提高18%、15%(先玉335)和8%、7%(金穗4號)。在抽雄期不同施肥處理下均表現為：處理B>C>A>D>E，處理B較A、E提高5%、17%(先玉335)和6%、18%(金穗4號)。在喇叭口期不同施肥處理下表現為：處理B>C>A>D>E，且處理B分別比A提高3.6%和5.8%，比處理E提高11.2%和16.2%。在成熟期不同施肥處理中，酶活性較灌漿期有所下降，表現為：處理B>C>A>D>E，處理B相較于A和E分別提高2.8%,11%(先玉335)和4.7%、14.7%(金穗4號)。

圖1 不同施肥處理對玉米不同生育期土壤過氧化氫酶影響Fig.1 Effect of different fertilization treatments on soil catalase in different growth stages of maize注：圖中不同小寫字母表示同一生育期、不同處理差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 復合菌劑對玉米根際土壤脲酶活性的影響 玉米生育期中根際土壤脲酶活性在不同施肥處理下均表現出：抽雄期>灌漿期>苗期>成熟期，且各生育期金穗4號土壤脲酶活性高于先玉335(除抽雄期外)。不同施肥處理間為：處理B>C>A>D>E，苗期不同施肥處理下，處理B比A分別提高8.9%(先玉335)和6.1%(金穗4號)，比處理E分別顯著提高14%和21%。抽雄期時，B處理分別較A、E提高了7.4%、23.4%(先玉335)和7.5%、21.3%(金穗4號)；金穗4號處理B顯著高于其他處理，先玉335處理B與C間差異不顯著，與A，D和E間差異顯著(P<0.05)。灌漿期時，不同施肥處理脲酶活性均達到最高值，處理B分別比A、E提高5.2%、21.6%(先玉335)和5.0%、21.2%(金穗4號)。成熟期時，脲酶活性在各處理中均有所下降，處理B分別較A、E提高9.3%、6.3%和17.5%、27.5%(圖2)。

2.1.3 復合菌劑對玉米根際土壤堿性磷酸酶活性的影響 不同施肥處理下，2個玉米品種根際土壤堿性磷酸酶活性在生育期呈現出：抽雄期>灌漿期>苗期>成熟期；抽雄期與灌漿期均呈現出金穗4號>先玉335，苗期和成熟期不同處理表現各異。抽雄期時，2個玉米品種表現為：B>C>A>D>E，處理B比A，E處理分別提高19.7%、53%(先玉335)和8.5%、31.9%(金穗4號)(圖3)。

2.1.4 復合菌劑對玉米根際土壤蔗糖酶活性的影響 不同施肥處理，2個玉米品種在生育期根際土壤蔗糖酶活性呈現出：灌漿期>抽雄期>成熟期>苗期(圖4)；在抽雄期和灌漿期，處理A和D蔗糖酶活性表現為金穗4號>先玉335，其他處理則表現為先玉335>金穗4號。在灌漿期，2個品種土壤蔗糖酶活性為：處理B>C>A>D>E，土壤蔗糖酶活性處理B比A和E分別提高24.5%，80.3%(先玉335)和13.7%、65.1%(金穗4號)。

圖2 不同施肥處理下玉米不同生育期土壤脲酶的含量Fig.2 Effect of different fertilizer treatments on soil urease in different growth stages of maize

圖3 不同施肥處理下玉米不同生育期土壤堿性磷酸酶的含量Fig.3 Effect of different fertilizer treatments on soil alkaline phosphatase in different growth stages of maize

圖4 不同施肥處理下玉米不同生育期土壤蔗糖酶的含量Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on soil invertase in different growth stages of maize

2.2 復合菌劑對玉米根際土壤微生物數量的影響

2.2.1 對玉米根際土壤細菌的影響 減量化肥處理B，C對玉米根際土壤細菌的影響顯著大于其他處理(表2)。對于先玉335處理，除全量化肥與復合微生物菌劑(D)無顯著差異，其他處理間細菌數量均差異顯著(P<0.05)，處理效果最佳的是B，較A、E處理分別增加1.310和3.705倍。對于金穗4號，各處理間均差異顯著(P<0.05)，表現出處理B>C>A>D>E的趨勢，且處理B分別較處理A和E提高1.94和4.8倍。且先玉335的根際細菌數量高于金穗4號。

2.2.2 對玉米根際土壤真菌的影響 玉米根際土壤真菌以不施肥(E)含量最多，但金穗4號較先玉335增加9%；整體而言，金穗4號土壤真菌較先玉335高，其中在復合菌劑處理下(B、C、D)，金穗4號和先玉335根際土壤真菌較未施復合菌劑(A、E)含量減少；對復合菌劑+減量化肥而言(B、C)，先玉335處理之間差異不顯著(P>0.05),金穗4號差異顯著(P<0.05)；在復合菌劑(D)處理下金穗4號和先玉335土壤根際真菌含量一致，均為4.5×105cfu/g(表2)。

2.2.3 對玉米根際土壤放線菌的影響 玉米根際土壤放線菌數量均表現為處理B>A>C>D>E(表2)。處理B土壤放線菌數量分別較處理E提高了2.0(先玉335)和1.9倍(金穗4號)，較處理A分別提高1.0(先玉335)和1.25倍(金穗4號)。

2.2.4 對玉米根際土壤3大微生物總數的影響 各處理均以復合菌劑+減量化肥(B、C)含量最多，但處理B均高于處理C，與全量化肥(A)處理相比，先玉335增加121.5%，金穗4號增加88.6%；全量化肥(A)和復合菌劑(D)相比，微生物總量以全量化肥(A)高于只施用復合菌劑(D)的處理；因此，微生物菌劑和化肥減量配施可以提高玉米根際微生物總量，但以85%化肥+復合菌劑對微生物總量的影響最為明顯。

表2 不同施肥處理下玉米土壤微生物的數量Table 2 Effect of different fertilizer treatments on the number of soil microbes in maize cfu/g

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

隨著人類對土壤學研究的深入及綠色無污染農業的全面認識，微生物菌劑在農業生產中的作用越來越受到重視，微生物菌劑含有的固氮菌能夠將空氣中游離的氮氣轉化為植物可吸收利用的氮素增加土壤總氮含量；一些具有分泌植物生長素的菌株通過代謝作用分泌植物激素被根系吸收，可促進植物的生長；溶磷菌能夠將土壤中難溶性的磷轉化為植物可吸收利用的有效磷供作物吸收，以此提高作物產量。土壤微生物也是土壤酶的來源之一，而土壤酶被認為是衡量土壤質量的指標，因土壤酶檢測方便，常用來間接衡量微生物的變化[22]。同時，微生物也是物質能量轉化的推動者，施用菌劑會影響土壤酶活性和養分元素含量[23]。施用復合PGPR接種劑能夠顯著提高土壤的速效養分和土壤蔗糖酶、過氧化氫酶和脲酶的活性[24-25]。也有研究報道，接種自生固氮菌對玉米根際土壤酶活性及細菌群落功能多樣性都有顯著影響，在接種褐球固氮菌和類芽孢桿菌后玉米根際脲酶活性較對照分別提高了20.55%和9.58%[26]；白菜根際土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶和磷酸酶活性較對照分別提高11.97、0.43、75.68和8.63倍，使土壤可培養細菌、真菌、放線菌數量較對照增加8.59，3.00和0.24倍[27]。研究均與試驗結果相類似，原因是(1)PGPR菌劑中含有的菌株具有一定的溶解無機磷的能力，可將土壤中難溶性磷轉化成可溶性磷；(2)菌株分泌IAA還能夠刺激植物根系生長，促進植物根系分泌作用，影響根際微生物活性和數量，間接或直接促進土壤酶活性的升高[28]；(3)PGPR菌劑的施用可以直接提高土壤中可培養微生物的數量[29]，且土壤酶活性與土壤中微生物數量顯著相關[22]，從而提高土壤酶活性。試驗發現在玉米各生育期，土壤酶活性總體表現為：處理B(菌肥+85%化肥)>處理C(菌肥+70%化肥)>處理A(全量化肥)>處理D(菌肥)>處理E(對照)，其中在抽雄期和灌漿期達到峰值。其原因可能是接種PGPR菌劑能夠有效改變植物的根系形態和根際細菌群落結構，促使根系分泌更多的含碳化合物，含碳化合物進而促進根際PGPR的生命活動[30-33]。全量化肥的施用可能會抑制土壤微生物的數量[31-33]，而單施微生物菌劑，可能是由于土壤中養分元素供給不足使菌株不能很好的定殖，造成土壤酶活性在不同處理之間差異性變化[34]。土壤微生物是維持土壤活力的主要指標，試驗采用傳統稀釋平板法測定玉米成熟期3大土壤微生物，結果表明增施菌肥對玉米根際微生物影響比較顯著，且以細菌最為明顯，其中處理B(復合菌劑+85%化肥)效果最佳，處理C(復合菌劑+70%化肥)次之，表明施用復合菌肥能夠大幅度增加土壤中微生物優勢菌群的數量[35]。且施用復合微生態菌劑后，前期可提高土壤中細菌和放線菌的數量，但隨生育期延長效果變弱[28]。土壤是一個巨大、復雜且穩定的生境，微生物活性與群落結構受到較多因素影響，使得接種外源微生物后對土壤土著微生物影響很小[35-36]，不宜于外來菌種微生物的成功定殖并發揮功效。研究發現施用菌肥可引起土壤微生物區系發生變化，除與接種外源微生物有關外，至于具體影響因素，有待于進一步研究。

4 結論

(1)不同施肥處理對2個玉米品種先玉335、金穗4號根際4種土壤酶活性均有不同程度影響，差異顯著(P<0.05)。在各生育期，土壤酶活性總體表現為：處理B(菌肥+85%化肥)>處理C(菌肥+70%化肥)>處理A(全量化肥)>處理D(全量菌肥)>處理E(對照)，其中在抽雄期和灌漿期達到峰值。

(2)施用復合微生物菌劑對2個玉米品種(先玉335、金穗4號)根際中土壤3大類微生物數量均有顯著影響，以細菌數量變化最為顯著。

(3)復合菌劑+85%化肥處理為適宜該地區的最佳施肥配比。