自噬抑制劑3-MA在神經系統疾病中的作用的研究進展

封秀梅，許明敏，黃 辰，李 瑛，張 微

(成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610075)

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性的細胞降解途徑，是機體內存在的一種自我修復和維持生命的過程[1]。近年來，自噬作用正逐漸成為神經系統疾病研究中的熱點，學者們發現自噬與神經系統疾病的發病機制密切相關[2-4]，而自噬抑制劑又被認為是探究疾病與自噬相關性以及開拓疾病新的治療措施的關鍵點。1892年Seglen等[5]用饑餓Wistar大鼠分離的肝細胞篩選嘌呤相關物質，首次發現了3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可作為自噬抑制劑，自此以后3-MA被普遍應用于自噬的機制研究，在神經系統疾病的研究中應用尤為廣泛。文章綜述了3-MA在神經系統疾病自噬研究中的作用及其應用概況，以期為疾病的預防和臨床治療提供一定的參考和指導。

1 3-MA與中樞神經系統疾病

1.1 3-MA與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury)是因各種原因造成腦組織缺血，經再灌注恢復供血后，機體損傷癥狀未得到改善反而加重的現象，是缺血性卒中主要的病理生理機制[6]。1995年Nitatori等[7]采用透射電子顯微鏡首次發現了腦缺血后神經細胞中存在自噬現象。近年來學者們也從生物化學和形態學等方面，先后證實了在腦缺血不同階段皆存在自噬激活現象，但3-MA在腦缺血中的確切作用一直存在著很大爭議。Puyal等[8]發現缺血區的微管相關蛋白LC3-II在缺血再灌注早期的數小時內開始升高，而使用3-MA則可顯著下調LC3-II的表達，同時減輕腦損傷，減小腦梗死病變區域。Wang等[9]于腦缺血再灌注后2 h經側腦室分別注射促黑激素(intermedin，IMD)和3-MA進行治療，24 h后發現IMD組和3-MA組自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I表達均較模型組明顯降低，提示IMD與3-MA具有相似的作用，均可改善病理性神經元損傷。Wen等[10]也揭示了3-MA可顯著減小腦梗死體積，降低腦水腫及運動缺失表現。相反地，Carloni等[11]發現腦缺血后皮質及海馬區的Beclin-1在短時間內顯著上調，且只在發生缺血缺氧損傷的神經元中表達，應用3-MA可加重腦損傷，明顯增多壞死細胞數量，提示3-MA在缺血缺氧早期對神經元具有損傷作用。Sheng等[12]同樣證實了3-MA可有效阻斷自噬的活性，降低缺血預處理對缺血再灌注損傷腦組織的保護作用，加劇神經細胞的壞死。

關于3-MA在腦缺血再灌注損傷中呈現出如此不同的作用，初步猜測主要是因為在腦缺血的不同階段自噬被激活的程度不一致。Shi等[13]在實驗中觀察到了3-MA在復氧不同階段的雙重作用，在24 h前再灌注，3-MA引發神經元死亡率高，而48～72 h再灌注，3-MA具有明顯保護神經元的作用，延長再灌注會引發過度的自噬，3-MA的作用也發生相應轉變。Zhang等[14]發現造模方式會影響3-MA的作用，在永久性腦缺血模型小鼠中，通過3-MA預處理可減小梗死面積，而在短暫性腦缺血模型小鼠中，再灌注開始后立即進行3-MA治療反而增加了梗死面積。此外，缺血程度、缺血區域、3-MA注射時間和注射周期、實驗動物及實驗環境等也可能是相關影響因素。因此，3-MA在腦缺血再灌注損傷中是加重還是減輕腦損傷不可一概而論，需考慮諸多可能的影響因素，進一步深入研究，若能正確引導自噬使其適時地在腦缺血的防治中發揮積極作用，這將為其治療開啟新紀元。

1.2 3-MA與脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的創傷性疾病，可導致神經功能缺損和運動功能障礙[15]。越來越多的研究發現3-MA在脊髓損傷中的作用值得深究。Zhang等[16]為研究自噬在脊髓損傷中的作用以及鋰的神經保護作用，在脊髓損傷6 h后對鋰組大鼠腹腔注射1 ml鋰(30 mg/kg)，而3-MA組在注射鋰的同時還于損傷前2 h腹腔注射1 mL 3-MA(3 mg/kg)，結果發現鋰能促進神經功能恢復和神經細胞存活，而3-MA下調了鋰誘導的自噬，抑制了其產生的神經保護作用。Li等[17]也在實驗中發現，于造模前20 min采用3-MA干預，能降低Beclin-1的表達，且抵消了雷帕霉素(rapamycin)產生的神經保護作用，加劇了神經元胞體的凋亡。相反地，有研究者[18]在實驗中自第十胸椎脊髓背側緩慢注射3-MA(200 nmol/L)，然后進行造模，結果發現3-MA對大鼠脊髓損傷具有保護作用。Lei等[19]的研究結果也支持3-MA在脊髓損傷中的積極作用。

Zhang等[16]與楊德剛等[18]的實驗中3-MA發揮著相反的作用，注射部位可能是關鍵，尚待驗證。在脊髓損傷后，自噬的水平將明顯上升，神經元的自噬水平與脊髓神經功能的恢復密切相關，正如Hou等[20]的實驗結果。Fang等[21]亦發現在脊髓缺血再灌注早期3-MA加重了再灌注產生的損傷，而在損傷72 h后，3-MA則減少了神經元的丟失，具有保護神經元的作用。也有研究[22]間接證明3-MA在體外可通過調節炎癥反應來調控脊髓損傷的修復進程。因此，深入了解3-MA在脊髓損傷中的作用機制，對神經損傷的恢復具有重要的臨床指導意義。

1.3 3-MA與帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以多巴胺能(dopaminergic，DA)神經元的進行性、廣泛性丟失及其胞內不溶性α突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)形成路易小體聚集為標志的中樞神經退行性疾病[23]。研究發現細胞自噬功能障礙可致α-Syn清除受損，而α-Syn的增多又可造成自噬功能受損，最終導致蛋白質異常聚集、線粒體功能障礙及神經細胞毒性等[24-25]。此外，包括PARK7基因[26]、PINK1基因[27]、PARK8基因[28]等與PD相關的基因都在一定程度上參與了自噬的過程，而近年來對此病的干預也主要集中在對其自噬水平的調節研究上。Jin等[29]在實驗中同時應用雷帕霉素和3-MA，結果顯示3-MA可增強腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)激發的小膠質細胞的神經毒性作用，造成更多DA神經元的丟失。Han等[30]在培養基中加入5 mM 3-MA，發現PLIN4沉默導致的神經保護被3-MA抑制。然而，有研究者[31]使用自噬抑制劑3-MA證實肉桂醛在PD模型中具有神經保護作用，提示抑制自噬可能是今后治療PD的新方向。

從當前的證據來看，3-MA在PD中發揮著雙重作用，一方面，3-MA阻礙自噬清除錯誤折疊的蛋白，從而導致PD的發生，而另一方面，3-MA可抑制過度激活的自噬，延緩PD的發展甚至避免PD的發生，再次驗證了自噬是一個動態變化的過程，不足或過度的自噬水平對神經細胞的損傷修復都是不利的。因此，進一步研究3-MA在PD中的調節機制，探討藥物治療的起效途徑，可為其治療提供新策略。

1.4 3-MA與其他中樞神經系統疾病

3-MA在其他中樞神經系統疾病中也有運用，如蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)及阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)等。Guo等[32]經腦室注射3-MA，發現3-MA可抑制白藜蘆醇激活的自噬，減緩神經功能的恢復。有研究[33]表明在小鼠TBI模型中，3-MA經側腦室預給藥后，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達水平明顯降低，減少了神經細胞死亡，減小了腦損傷面積，并能改善運動功能障礙，加速學習與記憶能力的恢復。有學者[34]發現電針能有效降低神經元凋亡，改善AD大鼠學習記憶能力，而在針刺前30 min經腹腔注射3-MA(0.5 mg/kg)后針刺的治療效應被阻斷。此外，在血管性癡呆[35]及癲癇[36]模型中，3-MA也被證實有助于神經的損傷修復。

2 3-MA與周圍神經系統疾病

周圍神經損傷后，神經軸突出現脫髓鞘病變、斷裂變性和神經水腫等，損害的遠端出現瓦勒氏變性等一系列的病理性改變[37]，而自噬能清除雪旺細胞內崩潰的髓鞘碎片和受損細胞器，促進損傷神經的修復[38]。Lu等[39]研究發現，大鼠再生的坐骨神經主要通過細胞自噬來維持正常形態，而[40]3-MA恰恰通過抑制自噬起相反的作用，使軸突和髓鞘再生受到抑制。還有學者[41]通過結扎坐骨神經建立神經性疼痛模型，于術后1 h經腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，證實了3-MA能抑制自噬，明顯惡化神經病變狀況。相同的，Chen等[42]也證實了周圍神經損傷激活了自噬，自噬參與了損傷的周圍神經的更新和再生，使用3-MA則阻礙神經的再生。

可見，在周圍神經系統疾病中3-MA不利于神經修復及再生。但目前3-MA在周圍神經系統疾病中的研究局限于坐骨神經損傷，尚缺乏對其他病種的研究。故筆者通過文獻研究認為，擴展病種，探索自噬在周圍神經損傷修復及再生中的具體作用及其可能機制具有重要的價值，這或許是今后研究的突破點。

3 3-MA在神經系統疾病中的使用

3-MA的注射頻次有單次注射[18]和多次注射[34,41]，可于造模前[16,35]或造模后[18,36]注射，主要根據實驗的目的靈活選擇。由于3-MA作為自噬抑制劑對Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的作用是短暫的[43]，而自噬又是一個動態變化的過程，故若想觀察疾病不同時間點的自噬水平，最好每日注射。3-MA在實驗中常選擇的注射部位為腹腔[16-17]或腦室[11,32]，也可經尾靜脈[44]或者脊髓注射[18]。不同部位的起效方式不同，腹腔注射主要通過體液循環最終作用于病所，可調整全身的自噬水平，但靶向性不強；而腦室注射直接作用于特定腦區，針對性強，但對動物的損傷較大，死亡率較高。在今后的研究中我們可多加論證其他部位注射的可行性，并進一步摸索其起效量及產生的一系列副作用。3-MA在培養基中常選用的濃度為5 mmol/L[5,30]，活體實驗中的使用濃度范圍在0.5～30 mg/kg[16,34,41]，這主要跟注射頻次及注射部位存在一定相關性。對于其配制方法，目前多用二甲基亞砜(dimethyl sulfone，DMSO)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、生理鹽水等溶解，也可以先用DMSO配制后再用PBS緩沖液緩沖至所需濃度。

4 3-MA作為自噬抑制劑的優缺點

3-MA作為自噬抑制劑，其優勢為對細胞的損害較小，且能夠特異性地抑制PI3K。PI3K是自噬激活的必要條件[45]，其主要有3種類型，分別是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PI3K。研究已證實了3-MA主要抑制Ⅲ型PI3K[46]，通過抑制Beclin-1-PtdIns 3KC3 復合物的形成來抑制胞漿可溶性形式LC3-I向自噬體膜結合形式LC3-Ⅱ轉化。最近的研究[43]表明3-MA在培養基中具有雙重作用，在營養缺乏培養基中抑制自噬，而在營養豐富的條件經過長時間的治療可促進自噬。關于3-MA促進自噬的研究目前較少，Wu等[43]證實了3-MA能持續阻斷Ⅰ型PI3K，其可能是通過抑制Ⅰ型PI3K下游的信號分子蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)在Thr308和Ser473處的磷酸化來激活自噬[47]，有待驗證。此外，3-MA在室溫下溶解性差，一般在使用前需在60℃～70℃的水浴中加熱促溶[48]，且僅在高濃度下有效。所以，開發可溶性高、特異性強的自噬抑制劑對神經系統疾病的研究是至關重要的。有研究[49]通過化學修飾3-MA，合成得到了三個3-MA的衍生物，它們表現出更高的可溶性和更強的特異性，且僅抑制Ⅲ型PI3K而不抑制Ⅰ型PI3K，不足的是對細胞存在一定毒性作用，可見利用化學修飾可能是優化3-MA性能的一種行之有效的方法。

自噬的機制十分復雜，3-MA不能完全抑制所有的自噬途徑，還有許多不受3-MA調控的信號通路。單純自噬體的減少不能準確判定自噬被抑制，有可能是自噬體與溶酶體的融合受阻，所以還需結合使用自噬體與溶酶體融合的抑制劑氯喹、巴佛洛霉素A1或敲除溶酶體關聯膜蛋白2來觀察自噬流的變化，進一步評判是否成功抑制自噬，以得到可靠的實驗結果。有研究顯示[5]5 mmol/L 3-MA對于自身自噬的阻斷可達到60%。然而，在研究電針對自噬水平影響的實驗中，3-MA似乎完全抵消了針刺的保護效應[35]，最可能的解釋是3-MA可抑制通過針刺預處理誘導的大部分自噬。郭科等[36]在造模后固定于每日上午8點注射3-MA，故3-MA的起效機制是否受晝夜節律影響有待驗證。

5 結語

綜上，自噬抑制劑3-MA被多方證實參與了神經細胞的損傷修復及再生過程，與大部分神經系統疾病的關系也已被廣泛研究并迅速成為神經科學領域的研究熱點，但在其中的具體作用受諸多因素影響。此外，缺乏高效的自噬抑制劑依舊是理解自噬在神經系統疾病中的生理病理作用的障礙所在，3-MA作為相對成熟的自噬抑制劑，在神經系統疾病研究中應用較為靈活，但仍存在諸多不足之處。因此，探索3-MA的更多特性，明確其在疾病不同狀態下的作用是當下需重點突破的難題，也將是今后神經系統疾病研究的關鍵所在。