高脂飲食誘導肥胖對雌性生育大鼠卵巢功能的影響

景彥林，楊修昭，白振軍，賀千里，彭志鋒

(1.山西大同大學中醫藥健康服務學院，山西 大同 037009； 2.大同市第五人民醫院，山西 大同 037009； 3.山西大同大學醫學院，山西 大同 037009)

肥胖是世界范圍內的一個公共健康問題。肥胖可影響女性的生殖能力。肥胖婦女發生不孕癥幾率為正常體重者3倍[1]。肥胖導致女性無排卵周期和月經不規則，降低植入率和妊娠率，還可能與多囊性卵巢綜合征有關[2]。以往研究表明，肥胖可通過影響卵子生長發育、排卵、內膜生長、胚胎發育和胚胎種植等多方面影響女性生育能力[3]。也有研究指出，高脂飲食(high-fat diet, HFD)誘導肥胖可促進卵泡發育及卵泡丟失，導致卵巢早衰[4]。還有研究表明，機體中過多脂肪不僅對女性，而且對肥胖動物模型生殖功能均有負面影響[5]。然而，過量體脂干擾正常卵巢功能機制還不清楚，特別是性激素及凋亡在其中作用。因而，本研究采用高脂肪/高熱量飼料喂養，建立Wistar雌性大鼠肥胖模型，深入探討肥胖對Wistar雌性大鼠卵巢功能的影響機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

80只雌性SPF級Wistar大鼠(5周)由山西醫科大學實驗動物中心提供[ SCXK (晉) 2015 -0001]，體重120～130 g。飼養于山西醫科大學實驗動物中心SPF級環境中[ SYXK (晉) 2015 -0001]。動物實驗嚴格按照山西醫科大學實驗動物管理委員會制定的操作規程 (IACUC號:2015011)，符合 3R 原則。Wistar大鼠隨機分為正常飲食組(對照組,n=40)和高脂飲食組(HFD組,n=40)。正常飲食大鼠以標準飼料配方飼養；而HFD大鼠以高脂肪/高碳水化合物飲食飼養，高脂飲食主要包括20%蛋白、35%碳水化合物和45%脂肪(購于中國醫學科學院實驗動物研究所)。飼養周期為2個月，每周測2次體重。肥胖判定標準：HFD大鼠體重超過control組20%，而且Lee’s指數顯著高于control組，即肥胖模型成功[6]。

1.2 實驗試劑

馬松三色染料(美國Sigma公司); TUNEL細胞凋亡試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；放射免疫分析試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠陰道涂片方法

飼養50 d時，在9～11點間對每只大鼠進行大鼠陰道涂片，通過顯微鏡檢查及時準確判斷大鼠的發情周期。

1.3.2 生化檢測及馬松三色染色

40只大鼠(每組各20只)在飼養60 d后第1個發情周期中的發情期麻醉后經心臟穿刺采血。血液儲存在試管，立即檢測血糖。血液進行離心處理，留取上部血清，置于-70℃冰箱中儲存。通過生化分析儀檢測甘油三酯、膽固醇和C-反應蛋白。然后取出卵巢，稱重，固定，脫水，切片，貼片，馬松三色染色。

1.3.3 懷孕準備

飼養大鼠60 d時，40大鼠(每組各20只)與有生育能力健康雄性大鼠合籠交配3周，雌雄大鼠比例為2∶1。分離雌鼠繼續飼喂，直至懷孕。

1.3.4 雌二醇和孕酮測定

從冰箱中取出儲存的血液。采用放射免疫分析試劑盒分別檢測血液中雌二醇和孕酮。

1.3.5 卵泡計數

如前面所述的大鼠卵巢馬松三色染色。在光學顯微鏡下觀察大鼠卵泡發育不同階段的細胞數量，包括原始、初級、次級、竇狀和排卵前卵泡[7]。

1.3.6 凋亡檢測

取出進行馬松三色染色的卵巢切片，參照試劑盒說明進行TUNEL原位染色，凋亡細胞核呈棕色。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 體重與代謝標志物

在研究開始之前，兩組大鼠體重無統計學差異。不同形式喂養后，兩組大鼠體重均增高。飼養60 d后，HFD組大鼠體重高于對照組大鼠，有統計學差異(P< 0.05)(圖1)，而且HFD組大鼠Lee’s指數高于對照組(P< 0.05)。盡管HFD組大鼠體重增高，但是HFD組大鼠血清甘油三酯、膽固醇和C-反應蛋白濃度未發生明顯改變。相比較，HFD組大鼠空腹血糖濃度高于對照組，有統計學差異(P< 0.001)，提示HFD誘導肥胖和高血糖。

2.2 發情周期分析

如圖2所示，陰道細胞學檢查發現，與對照組相比，HFD組大鼠發情周期較長，而發情后期持續時間較長，發情間期也較長。

表1 研究前1 d及飼養60 d體重及代謝參數變化(n=40)

注：與對照組相比，*P<0.01;與第1天相比，#P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.01. Compared with the first day,#P< 0.01.

注：與對照組相比,*P<0.05。圖1 兩組飼養大鼠體重變化(n=40)Note. Compared with the control group, *P < 0.05.Figure 1 Weight change of the rats in two groups

注: D:發情間期; M:發情后期; P:發情前期;O:發情期。圖2 肥胖對大鼠發情周情的影響(n=20)Note. D， Interestrus. M，Late estrus. P，Preestrus. O，Estrus.Figure 2 Effects of obesity on estrous cycle in the rats

2.3 血清孕酮和雌二醇測定

由于大鼠發情周期發生變化，下面進一步分析卵巢功能是否受到肥胖的影響。因而對血清孕酮和雌二醇濃度進行分析。其中兩組大鼠血清孕酮濃度無統計學差異；而HFD組大鼠血清雌二醇濃度低于對照組(P< 0.05)(圖3)。

2.4 卵巢形態分析

肥胖導致大鼠血清雌二醇濃度降低，下面進一步觀察肥胖對卵泡發育各階段的影響。如圖4所示，兩組大鼠卵泡發育各個階段(原始、初級、次級、竇狀和排卵前卵泡)卵泡數量無統計學差異。此外，兩組大鼠黃體數量也無統計學差異。然而，在HFD組大鼠發現卵泡囊腫。

2.5 凋亡分析

TUNEL分析顯示，兩組大鼠竇狀前、竇狀、排卵前卵泡及黃體均有凋亡細胞(圖5)。其中HFD組大鼠竇狀卵泡凋亡數量高于對照組，有統計學差異(P< 0.001)；然而兩組間竇狀前、排卵前卵泡及黃體凋亡細胞數量無統計學差異(圖6)。

注:與對照組相比,*P<0.05。圖3 肥胖對大鼠血清孕酮和雌二醇影響(n=20)Note. Compared with the control group, *P < 0.05.Figure 3 Effects of obesity on serum progesterone and estradiol in the rats

圖4 定量分析原始、初級、次級、竇狀、排卵前卵泡及黃體和囊腫(n=10)Figure 4 Quantitative analysis of primitive, primary, secondary, sinusoidal, preovulatory follicles, corpora lutea and cyst in the rats

圖5 典型卵巢切片TUNEL染色(箭頭指示凋亡細胞，× 400)Figure 5 Typical histology of a rat ovary. An arrow indicates apoptotic cells. TUNEL staining

2.6 妊娠分析

與雄性大鼠合籠3周，絕大多數HFD組大鼠(9/10)均懷孕。然而，HFD組大鼠懷孕晚于對照組大鼠。HFD組大鼠在發情周期循環2～3次才能懷孕，而對照組大鼠在第1個發情周期內懷孕(P< 0.01)(圖7)。

3 討論

本研究結果表明，HFD誘導的肥胖可影響雌性大鼠生殖功能。以往研究表明，肥胖與葡萄糖穩態紊亂密切相關，可能與胰島素調節外周組織葡萄糖代謝能力下降有關[8]。這些失衡也存在于HFD誘導的肥胖中[9]。因為HFD可增加動物能量攝入，并引起肥胖。在本研究中，HFD喂養的老鼠不僅發生肥胖，而且血糖濃度異常升高，從而也支持上述觀點，HFD可減少胰島素調節糖代謝的能力。肥胖與炎癥狀態有關，而且膳食中脂肪含量影響炎癥[10]。為了檢測HFD是否引起炎癥反應，測定大鼠中血清C-反應蛋白濃度，但無變化。結果提示肥胖老鼠不形成炎性反應。一個可能的解釋是HFD中除了脂肪，碳水化合物含量也較高，再加上飼養時間只有2個月，所以沒有提供足夠脂肪來激活炎癥通路[11]。此外，也有報道稱飲食誘導胰島素抵抗初始階段與炎癥不相關[12]。

注：與對照組相比，***P<0.001。圖6 定量分析大鼠動情周期中各期卵泡和黃體的凋亡細胞情況(n=10)Note. Compared with the control group, ***P<0.001.Figure 6 Analysis of the apoptotic cells in the rat follicles and corpora lutea during the estrous cycle

圖7 肥胖對大鼠生殖的影響(n=20) Note. Compared with the control group, ** P< 0.001.Figure 7 Effects of obesity on reproduction in the rats

雌激素是由卵泡顆粒細胞在生育期間產生的，肥胖對其合成影響是有爭議的。已有研究報道，肥胖女性血清雌激素濃度高于正常體重女性；但是也有研究指出，肥胖女性血清雌激素濃度較低，可能是由于體重可直接抑制促性腺激素和雌激素的產生[13-14]。與以往研究結果一樣，在本研究中發現HFD大鼠血清雌激素濃度降低。眾所周知，雌激素抑制女性食物的攝入和飲水。在嚙齒類動物中，卵巢切除術導致肥胖發生，而補充雌激素可抑制肥胖的發生[15]。所以HFD會導致肥胖，而較低雌激素濃度可能也是肥胖發展的一個重要原因。低濃度雌激素誘導大鼠發情間期延長。據報道，45 d 高脂飲食與大鼠發情周期及發情間期延長有關，而跟換普通飼料可糾正不規則的發情周期[16]。在本研究中，人們發60 d HFD飼養導致大鼠血清雌激素降低，以及發情間期延長。雌激素在生殖過程中起著關鍵作用，可影響卵泡的生成。雌激素缺乏導致卵泡閉鎖，最終引起毛囊早期衰竭[17]。此外，雌激素可抑制顆粒細胞凋亡和維持黃體功能[18]。在本研究中，與對照組大鼠比較，肥胖大鼠血清雌激素降低，同時伴隨著竇狀卵泡凋亡數量增加，結果提示HFD誘導的雌激素降低與閉鎖卵泡數量增加相關。

總之，目前結果表明，HFD可誘發大鼠產生肥胖，肥胖可通過降低血清雌激素濃度，卵泡閉鎖，延遲懷孕，最終降低成年雌性大鼠的生殖能力。