葛根素對急性肝衰竭小鼠的治療作用及其作用機制

劉英輝，周東方，金國華，閆文昭，程 欣

(河北醫科大學第三醫院，石家莊 050000)

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是可由多種原因引起的危重疾病，主要臨床表現多為同時出現凝血機制障礙、黃疸、腹水等癥候[1]。ALF具有隱匿性強、發病迅速等特點，雖然發病率較低，然而目前尚缺乏特異性的治療措施，致死率很高，引起醫學界的廣泛關注[2]。ALF發病機制復雜，其病理基礎是肝臟細胞在短時間內大量死亡，導致肝臟合成、解毒、轉化等能力發生功能性障礙或失代償[3]。研究表明，在細胞凋亡過程中，磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路對相關蛋白的調節發揮關鍵作用，可將膜受體信號傳遞至細胞內，來實現維持細胞增殖和抑制細胞凋亡過程[4]。作為Akt的底物，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是調節細胞凋亡的關鍵元件[5]。葛根作為我國傳統名貴的中草藥，具有多種活性成分，其中葛根素除具有提高免疫、增強心肌收縮力，保護心肌細胞，降血壓等作用外，對肝損傷的保護作用也已廣泛報道[6]。但葛根素(puerarin，Pue)對D-氨基半乳糖所致的急性肝衰竭小鼠肝臟的保護作用機制，目前尚鮮見報道。因此本研究采用D-氨基半乳糖誘導急性肝衰竭小鼠模型，探討葛根素對肝臟的保護作用，同時分析其對PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的調控作用，為進一步研究相關機制提供相應的實驗基礎。

1.1 實驗動物

SPF級成年雄性昆明小鼠50只，體重在(20±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 [SCXK(京)2011-0011]，所有動物均在本實驗室SPF級動物房飼養[SYXK(冀)2015-0042]。動物的使用及操作按照本院動物管理委員會(IACUC2017-002) 的規定執行。實驗過程中遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

葛根素(批號：070319812，純度> 98%)購自昆明制藥廠，用前以生理鹽水稀釋(pH 7.0)，根據體重計算給藥體積，4℃保存；丙二醛(malondialdehyde，MDA)(批號：SGA103)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號：SE103)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)(批號：SA625)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransfease,，ALT)(批號：2017030928)，天門冬氨酸基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)(批號：2017110812)，總膽紅素(total bilirubin，TBil)(批號：2017210612)，試劑盒購自上海瀚鴻化工科技有限公司；TUNEL試劑盒(批號：C503028)購自德國羅氏公司；LY294002(批號：BE28491)購自瀚香生物科技有限公司；D-氨基半乳糖(批號：AP1062)購自美國 Sigma 公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(20170212)、DAB化學發光試劑盒(批號：D29183874)、P-Akt(批號：E289180)、P-GSK-3β (批號：A1209300)、cleaved caspase-3 (批號：A1805603) 抗體均購自上海仁捷生物科技有限公司。萬濠VTM-4030光學顯微鏡，上海長島生物技術有限公司AVDIA2400全自動生化反應儀檢。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型制備

將50只昆明小鼠適應性飼養7 d后隨機分為5組，每組10只：(1)正常對照組；(2)模型組；(3)Pue組(300 mg/kg)；(4)P13 K特異性抑制劑LY294002組(LY，10 mg/kg)；(5)Pue(300 mg/kg)聯合LY294002(10 mg/kg)組(Pue+LY組)。Pue組、LY組及Pue+LY組造模前根據實驗設計需要給予相應藥物，每日1次，連續給藥兩周，給藥方式為尾部靜脈注射，正常對照組和模型對照組均以同樣方式注射等量無菌生理鹽水。末次給藥后禁食24 h，除正常組外，其他組腹腔注射10% D-氨基半乳糖(1.2 mL /100 g)造模，正常對照組注射等量生理鹽水。

1.3.2 血清及肝臟生化指標檢測

建模后8 h，采集各組小鼠靜脈血，引頸處死小鼠后固定，沿腹中線切開腹壁，暴露腹腔組織，小心分離肝臟。常規分離靜脈血血清，4 h內采用全自動生化反應儀檢測小鼠ALT、AST、TBil、Alb肝功能指標。準確稱量部分肝臟組織，加入預冷的PBS緩沖液制成 10% 勻漿，4℃下4000 r/min離心10 min，取上清依據SOD、GSH-Px和MDA檢測試劑盒說明書所示的操作方法進行測定，并計算每克肝組織中的活性或含量。

1.3.3 HE染色觀察小鼠肝臟組織形態變化

切取部分肝臟右葉，采用4%的甲醛固定24 h后進行常規脫水和石蠟包埋，將小鼠肝臟組織石蠟塊切成5 μm厚度的切片，進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察組織學改變。

1.3.4 TUNEL 法檢測肝臟細胞凋亡

取小鼠部分肝臟組織切片按試劑盒步驟進行TUNEL染色。主要步驟為切片脫蠟水化后，蛋白酶 K(10 mmol/L)處理 20 min，PBS 清洗 5 min×3 次，將載玻片浸入 TUNEL 反應混合物在37℃下避光溫育60 min，PBS 清洗5 min×3 次；在 37℃ 下，用 POD 反應液避光溫育30 min；PBS 清洗 5 min×3 次；滴加 DAB 底物溶液顯色，室溫孵育 10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝細胞凋亡情況。以顯示藍色的核染色為正常細胞，細胞核中有棕黃色顆粒為陽性細胞(凋亡細胞)。凋亡細胞所占百分比(凋亡率)：每只小鼠取 4 張切片，每張切片在200 倍視野下隨機選取 3 個不重疊視野，每個視野計數陽性細胞占總細胞的比例，取平均值即為細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot法檢測肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β、cleaved caspase-3表達的影響

取小鼠部分肝臟組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后離心，離心條件：13000 r/min，4℃，時間10 min，獲得上清，BCA蛋白定量試劑盒進行上清中蛋白濃度的定量檢測，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉移至PVDF膜上，5% TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應一抗稀釋液(均為1∶1000)中孵育，4℃過夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 葛根素對ALF小鼠肝功能的影響

血清 ALT、AST、Tbil水平是臨床反映肝細胞損傷和壞死程度的敏感指標，與正常對照組相比，模型組小鼠ALT、AST、Tbil指標明顯升高，差異有統計學意義(P< 0.05)，經Pue預處理后，與模型組相比，Pue組肝功能指標出現明顯下降，差異有統計學意義(P< 0.05)，LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表1。

表1 葛根素對ALF小鼠肝功能的影響

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

2.2 葛根素對ALF小鼠肝臟病理的影響

HE 染色結果顯示，正常對照組小鼠肝臟細胞結構完整，排列有序，細胞核體積較大，具有明確的核染色和正常的形態，并沒有發生損傷壞死現象；模型組小鼠肝臟細胞變小、變圓，有小的、質密不規則的固縮核為死亡的肝臟細胞；Pue可明顯減少肝臟細胞丟失，改善細胞異常形態；LY組、LY+Pue組小鼠肝臟病理結構與模型組相似。見圖1。

注：A：正常對照組，B：模型組，C：Pue組，D：LY組，E：Pue+LY組。圖1 葛根素對ALF小鼠肝臟病理的影響(×200)Note. A， Normal group. B， model group. C， Pue group. D， LY group. E， Pue+LY group.Figure 1 Effects of puerarin on liver pathology of the ALF mice

注：A：正常對照組，B：模型組，C：Pue組，D：LY組，E：Pue+LY組。與正常對照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖2 葛根素對ALF小鼠肝臟細胞凋亡的影響(TUNEL染色)Note. A， Normal group. B， Model group. C， Pue group. D， LY group. E， Pue+LY group. Compaed with the normal control group, *P< 0.05. Compared with the model group, # P< 0.05.Figure 2 Effect of puerarin on the hepatocyte apoptosis in ALF mice. TUNEL staining

2.3 葛根素ALF小鼠肝臟細胞凋亡的影響

ALF小鼠肝臟經過TUNEL法染色在光鏡下觀察呈棕色，如圖2所示，正常對照組肝臟細胞并未出現明顯凋亡現象，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟細胞出現嚴重凋亡，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，Pue組小鼠肝臟細胞凋亡明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 葛根素對ALF小鼠肝臟組織中氧化應激的影響

SOD、GSH-Px和MDA作為機體氧化應激反應的代表物質，本研究檢測了ALF小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px和MDA 的水平，結果顯示和正常對照組相比，模型組中SOD、GSH-Px水平出現明顯的降低，MDA水平明顯的升高(P<0.05)；與模型組相比，Pue組中SOD、GSH-Px水平出現明顯的升高，MDA水平明顯的降低(P<0.05)；LY組、Pue+LY組小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px和MDA 的水平與模型組相比，差異無具統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.5 葛根素對ALF小鼠肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β及cleaved caspase-3表達的影響

為了進一步觀察Pue對ALF小鼠模型肝臟的保護作用機制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測了肝臟組織中Akt、GSK-3β和cleaved caspase-3蛋白磷酸化水平，結果顯示與正常對照組相比，模型組中Akt、GSK-3β磷酸化水平明顯下降(P<0.05)，cleaved caspase-3明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，Pue組小鼠肝組織中Akt、GSK-3β磷酸化明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，cleaved caspase-3明顯下降(P<0.05)，LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：與正常對照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖3 葛根素對ALF小鼠肝臟組織中氧化應激的影響Note. Compared with the normal control group, *P< 0.05. Compared with the model group, #P < 0.05.Figure 3 Effect of puerarin on oxidative stress in the liver tissues of ALF mice

注：與正常對照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖4 Pue對ALF小鼠肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β、cleaved caspase-3表達的影響Note. Compared with the normal control group, *P < 0.05. Compared with the model group, #P < 0.05.Figure 4 Effects of Pue on the expression of p-akt, p-gsk-3 and cleaved caspase-3 in the liver tissues of ALF mice

3 討論

ALF是以肝功能迅速惡化為臨床特點的急性綜合征[7]。患有慢性肝炎、肝纖維化等慢性肝病的患者可在勞累、飲酒、病毒感染等誘因下出現肝臟大面積死亡直至衰竭，其中以感染最為多見[8]，治療困難，給患者家庭造成沉重的負擔。研究ALF疾病的發展規律、促進臨床治療及肝臟組織修復一直以來是科學界研究的熱點之一。

現代藥理學認為，Pue可以提高自身免疫力，降血脂等多種生物學功能[9]，隨著研究的深入，Pue對肝臟細胞損傷方面的研究逐漸增多。金若天等[10]采用透射電鏡發現Pue預處理可以顯著降低肝臟缺血再灌注損傷后大鼠肝細胞凋亡率。另有報道，通過研究Pue對葛根素對四氯化碳所誘導肝纖維化大鼠的肝臟的影響，發現Pue對于肝臟組織中caspase-9蛋白的表達具有顯著的抑制作用，且通過TUNEL染色法發現肝臟細胞凋亡率明顯減少，提示Pue對于多種原因引起的肝細胞凋亡起到保護作用[11]。本研究通過D-氨基半乳糖誘導ALF小鼠模型研究Pue的藥理作用，發現模型組小鼠肝功能指標明顯降低，且肝臟組織細胞凋亡數目增多。本研究根據預實驗結果選擇Pue給藥濃度，結果表明，經過Pue預處理的小鼠與模型組相比，減輕D-氨基半乳糖對肝功能的損傷程度，肝細胞凋亡受到抑制，與既往研究結果一致。

細胞內經過一系類復雜的信號傳遞實現了機體生物學行為，PI3K/Akt信號通路通過胞內信號傳遞在細胞遷移、動員、分化和抗凋亡等細胞生存調節過程中發揮重要的作用，在近年來的研究中越來越受到重視[12]。LY294002是公認的PI3K抑制劑，可特異性抑制PI3K110亞基單元的活性，阻斷PI3K介導的信號通路[13]。本研究中使用LY294002驗證Pue對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的調節保護D-氨基半乳糖誘導的ALF的作用機制，結果顯示，Akt和GSK-3β磷酸化水平在Pue組與模型組相比大幅增加，而Pue+LY組較Pue組下降明顯，LY294002逆轉了Pue介導的Akt和GSK3β磷酸化水平，提示Pue可通過PI3K來實現Akt和GSK3β磷酸化進程。有研究表明[14]，PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制肝臟細胞的凋亡，同時在后期參與了其修復過程，從而對肝臟生理功能起到保護作用。與Pue組相比，Pue+LY組小鼠肝功能明顯降低，且肝細胞凋亡的數量增加，提示Pue可能是通過調控PI3K/Akt/GSK-3β信號通路實現對肝細胞的保護作用。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases) 在細胞凋亡過程中發揮重要作用，caspase可將自身底物水解傳遞至凋亡通路，引起蛋白酶級聯反應導致細胞程序性死亡[15]。cleaved caspase-3是caspases 級聯反應中下行的最關鍵蛋白酶，在凋亡程序中起到中樞作用[16]。本研究ALF小鼠經Pue預處理后檢測cleaved caspase-3的表達，結果顯示，cleaved caspase-3出現下調，提示Pue抑制D-氨基半乳糖誘導所致ALF小鼠肝細胞凋亡可能是通過下調cleaved caspase-3來實現的。與Pue組相比，Pue+LY組cleaved caspase-3表達明顯增加，說明該作用機制與PI3K/Akt通路有關。

文獻報道稱[17]，PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可介導細胞發生氧化應激反應。Lee等[18]研究發現，隨著GSK-3β磷酸化水平的升高，血清中SOD活性和 GSH/GSSG 的比值隨之增高，同時MDA含量下降，通過GSK-3β抑制劑(TDZD-8) 處理后，抗氧化作用被明顯逆轉。而氧化應激在ALF的發生發展中發揮著關鍵作用[19]。肝臟組織在自由基的作用下發生脂質過氧化，生成MDA等物質，嚴重者會造成肝組織細胞的DNA損傷[20]。本研究中，模型組昆明小鼠肝臟組織因注射D-氨基半乳糖，其肝組織中SOD活性和 GSH-Px 含量明顯降低，而MDA的含量明顯上升，說明D-氨基半乳糖誘導的ALF模型小鼠機體內發生氧化應激反應，并對小鼠肝組織造成氧化性損傷。Pue組可以明顯改善小鼠肝組織中SOD、GSH-Px和MDA水平，而LY組、Pue+LY組氧化應激指標與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)，提示Pue會減輕D-氨基半乳糖誘導的ALF小鼠氧化應激狀態而對肝臟起到保護作用，可能與GSK-3β信號通路有關。

綜上所述，Pue可能通過激活PI3K/Akt信號通路，從而減輕肝功能的損傷程度，抑制肝臟細胞凋亡的發生，減輕機體氧化應激狀態，發揮對D-氨基半乳糖誘導的ALF小鼠肝臟的保護作用。但Pue是否還能通過調節其他通路來影響疾病進程，仍需進一步的研究。