正五聚蛋白3在兒童過敏性紫癜中的臨床意義

劉鑫， 楊達勝

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura，HSP)是一種常見的系統性小血管炎癥性疾病，其病理特點是IgA介導的全身小血管炎癥性損傷，HSP累及腎臟造成腎臟損傷被稱為紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN)。腎累及是影響HSP兒童長期預后的關鍵因素。確診HSP腎損傷最可靠的證據是腎活檢，但因小兒腎活檢具有侵襲性，可能導致泌尿系統出血性損傷，風險較大，多數患兒及其家屬難以接受。現臨床上應用的腎損傷指標如血漿肌酐、血漿尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白都在一定程度上存在一些局限性，影響預測早期腎損傷的發生，所以仍需尋找、研究新的生物標記物來更好的對腎損傷的早期做出預測，從而早發現、早治療，達到良好的預后。

正五聚蛋白是一種多功能的保守蛋白，五聚素3屬于長鏈正五聚蛋白，除炎性細胞因子外，Toll樣受體激動劑，如脂多糖、外膜蛋白A和完整的微生物，都能快速誘導多種細胞類型的五聚素3表達，包括髓樣樹突狀細胞、腎上皮細胞、系膜細胞和顆粒細胞等。有研究表明，在IgA腎病患者的腎活檢中，在擴張的系膜區域的腎小球系膜和內皮細胞中觀察到五聚素3的強烈染色。與這些發現相反，腎小球腎病患者的正常腎組織和活檢對五聚素3表達主要為陰性[1]。在IgA腎病中，五聚素3通過誘導繼發性介質(例如血小板激活因子)的產生，參與到血管內皮細胞和內皮細胞的活化中，這一機制可能導致腎小球和腎小管間質損傷。在腫瘤壞死因子α和IgA刺激下，體外培養的人腎小球系膜細胞合成五聚素3，并表現出重組五聚素3的特異性結合[2]。五聚素3誘導的系膜細胞的細胞形態(細胞收縮)的形態學改變與腎小球濾過面積和濾過系數的減少有關。由于五聚素3與IgA腎病的發生和發展有關，所以推測五聚素3也有可能與HSPN存在或多或少的相關性，然而關于五聚素3在HSPN中的研究很少。本研究通過對50例HSP患兒及20例正常兒童檢測其血漿及尿液中五聚素3的表達水平，探討其在HSP中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月至2017年9月新鄉醫學院第一附屬醫院兒科收治的HSP患兒50例，根據有無累及腎臟分為HSP組32例和HSPN組18例。HSP組中男18例，女14例；年齡4～12歲，平均年齡(7.09±2.70)歲。HSPN組中男8例，女10例；年齡3～10歲，平均年齡(6.89±2.21)歲。同期選取門診健康體檢的20例正常兒童作為對照組，其中男9例，女11例；年齡4～10歲，平均年齡(7.25±1.91)歲。3組研究對象在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照2013年中華醫學會兒科學分會免疫學組制定的《兒童過敏性紫癜循證診治建議》中的HSP的診斷標準[3]。參照2016年由中華醫學會兒科分會腎臟病學組制定的《紫癜性腎炎診治循證指南》中HSPN的診斷標準[4]。

1.3 納入標準 (1)符合HSP和HSPN的診斷標準；(2)年齡3～12歲；(3)本研究經醫院倫理委員會審核批準(批準編號：2016090)，患兒家屬知情同意。

1.4 排除標準 (1)IgA腎病；(2)血小板減少性紫癜；(3)系統性紅斑狼瘡、冷球蛋白血癥等繼發性小血管炎；(4)肝炎、結核等造成的血尿和(或)蛋白尿；(5)合并感染的HSP；(6)隨訪6個月，血尿/蛋白尿持續不轉陰的HSP；(7)臨床資料不全者。

1.5 研究方法

1.5.1 標本的采集及處理 所有受試者入院次日或體檢當日清晨取外周靜脈血2 mL及晨起清潔中段尿液，待受試者達到恢復期時再次采集受試者空腹時靜脈血2 mL及清晨清潔中段尿液，靜脈血樣本應用乙二胺四乙酸抗凝管收集，尿液樣本應用無菌管收集，所有樣本均在離心機以2 000 r/min離心20 min，收集上清，并儲存于-80 ℃冰箱凍存以待檢驗。血漿及尿液五聚素3濃度測定均采用酶聯免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，實驗室流程及具體試驗方法均按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 結果計算 以標準物的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，計算出標準曲線的多項式二次回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.6 觀察指標 各組血漿和尿液中五聚素3表達水平；HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平。

2 結果

2.1 各組血漿和尿液中五聚素3表達水平比較 見表1。

表1 各組血漿、尿液中五聚素3表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HSP組比較，bP<0.05。

表1結果表明，HSP組和HSPN組血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；HSPN組血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著高于HSP組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平比較 見表2。

表2 HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平比較

注：與急性期比較，at=3.708，3.327，12.546，9.364，P<0.05。

表2結果表明，HSP組和HSPN組恢復期血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著低于急性期，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

HSP是兒科常見的全身性免疫性小血管炎癥性疾病，其致病因素眾多，其中感染因素(如細菌、病毒、支原體、寄生蟲等)最為常見，其次食物及藥物因素、遺傳因素及疫苗接種因素等。本病發病機制尚未完全闡明，但一般認為主要涉及遺傳學背景及感染或過敏后機體免疫紊亂(IgA、補體系統相關體液免疫紊亂、T淋巴細胞異常相關的細胞免疫等)[5-6]、炎性細胞和炎性細胞因子的作用、凝血和纖溶機制的參與等幾個方面。影響HSP兒童長期預后的關鍵因素在于有無存在腎臟損害，在疾病早期發現腎臟損害，并予以相應的治療對HSP患兒的預后有很大的干預作用，現階段的腎損傷標志(血漿肌酐、血漿尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白等)都有一定程度的局限性，因此尋找、研究新的生物標記物來更好的對腎損傷的早期做出預測至關重要。

正五聚蛋白是一種具體多種生物活性功能的保守蛋白。主要依據蛋白質一級結構的差別分類。經典的短正五聚蛋白包括C反應蛋白和血漿淀粉樣蛋白P，主要在白細胞介素6的刺激下由肝臟合成。而五聚素3是由炎性細胞因子(除了白細胞介素6)、Toll樣受體激動劑，誘導多種細胞類型產生的一種長鏈正五聚蛋白[7-8]。白細胞介素6不能誘導活性細胞內五聚素3的合成，從而強調了長鏈正五聚蛋白全身性活動性與短鏈正五聚蛋白不同[9]。人的五聚素3基因位于染色體3(q24-28)的長臂上，包含3個外顯子編碼，分別用于領導肽、n-端域和五聚素3蛋白(相對分子質量40 165)的c-末端正五聚蛋白相似域[10]。五聚素3與眾多免疫系統相關性疾病有著密切的關系，各系統免疫相關性疾病中都可以發現五聚素3的高表達[11]。最近的研究表明，PTX3可能具有作為臨床腎臟學的治療靶點的潛力。與健康的人腎臟相比，五聚素3在髓質外的腎小管周圍內皮細胞上幾乎完全表達[12]，免疫組化研究發現，在系膜區內炎性細胞浸潤腎小球、間質和腹膜毛細血管均有五聚素3的表達。臨床研究顯示在Ⅱ型糖尿病腎臟病患者中血漿五聚素3濃度水平升高，糖尿病腎臟病伴有微量白蛋白尿時血五聚素3濃度即明顯升高，隨著蛋白尿的增多，血五聚素3濃度進一步升高[13]。在缺血-再灌注損傷小鼠模型中腎臟內皮細胞[14]、Ⅰ型膜性增生性腎小球腎炎患者的腎小球系膜和內皮細胞都發現五聚素3表達增加。有研究表明，在IgA腎病患者的腎活檢中，在擴張系膜區域的腎小球系膜和內皮細胞中觀察到五聚素3的強烈染色，而在正常腎組織和活檢對五聚素3表達主要為陰性[1]。在IgA腎病中，五聚素3通過誘導繼發性介質(例如血小板激活因子)的產生，參與到血管內皮細胞和內皮細胞的活化中，這一機制可能導致腎小球和腎小管間質損傷。由五聚素3與IgA腎病有關，可推測五聚素3在HPS，尤其是HSPN中可能也發揮著一定的生物功能。

本研究采用ELISA法檢測HSP及過敏性HSPN患兒血漿及尿液中五聚素3的表達水平，通過比較恢復期與急性期血漿及尿液中五聚素3的表達水平，結果發現，經有效治療后，血漿及尿液中五聚素3表達水平較治療前顯著降低，提示五聚素3表達水平的檢測可以反映HSP疾病的活動狀態，與多項相關性研究結果一致[1，15-19]。

此外，本研究還發現，HSP患兒血漿及尿液中五聚素3的表達水平比正常兒童血漿及尿液中五聚素3的表達水平明顯升高，尤其以HSPN患兒更為顯著，提示五聚素3可能成為HSP患兒腎損傷的一項新的檢測指標，與Ge等[20]的研究結果一致，并且他們還發現HSPN血漿中五聚素3表達水平與尿液中微量白蛋白、24 h尿蛋白定量呈正相關。同時，有研究表明，IgA腎病患者中腎炎型、腎病型患者蛋白尿程度越重，血漿和尿液中五聚素3表達水平升高越顯著，提示HSPN患兒血漿和尿液中五聚素3的表達水平腎損傷的嚴重程度呈正相關[21]。HSP患兒血漿及尿液中五聚素3表達水平變化的機制可能與五聚素3在血管炎癥損傷中的作用密切相關。HSP患兒血漿中白細胞介素1、白細胞介素4、腫瘤壞死因子α的表達水平顯著升高，這些細胞因子可促使五聚素3的生物合成增加。五聚素3還可以抑制巨噬細胞對晚期凋亡的中性粒細胞的吞噬作用，導致其在血管壁聚集，HSP時五聚素3的高表達水平有助于延遲凋亡中性粒細胞的清除，促進白細胞碎裂性血管炎的形成[22]。五聚素3亦屬于成纖維細胞生長因子家族：成纖維細胞生長因子2和成纖維細胞生長因子8b的天然選擇性拮抗劑，五聚素3對成纖維細胞生長因子2的特異性抑制作用能達到抗血管生成的效果。一氧化氮通路的受損是導致內皮功能障礙的主要機制之一[23]，在實驗模型中，五聚素3通過P-選擇素/基質金屬蛋白酶1途徑，使小鼠抵抗血管內皮功能受損，從而引起內皮細胞形態學改變和一氧化氮通路的受損。而在HSPN中，HSP血漿及尿液中的機制同樣可以解釋，有研究表明，HSPN和IgA腎病患者血漿半乳糖缺陷的IgA1(galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1)水平顯著升高，這提示Gd-IgA1在HSPN的發病機制中起到關鍵作用，Gd-IgA1免疫復合物在腎小球系膜區沉積，可激活系膜細胞，而系膜細胞的活化可促進五聚素3的生成[24]。此外，炎性細胞因子可以誘導腎小球上皮細胞合成五聚素3。

綜上所述，五聚素3表達水平的檢測不僅能反映HSP疾病的活動狀態，還可能成為HSP患兒腎損傷的一項新的檢測指標。