工廠化栽培淺黃色金針菇雜交菌株選育初探

張根偉 谷雨泰，2 劉振國 劉昆昂 劉 萌 李書生* 董 杰

（1河北省科學院生物研究所，河北石家莊050081；2北京市第二中學，北京東城100010）

金針菇（Flammulina velutipes）又名構菌、冬菇、毛柄金錢菌等[1]，按子實體顏色可將金針菇分為黃色金針菇和白色金針菇[2]。黃色金針菇是我國傳統金針菇生產品種，相對于白色金針菇，具有抗性強、產量高、營養價值高、口感脆爽等特點[3]。有研究表明，黃色金針菇蛋白質、賴氨酸等含量遠高于白色金針菇，這可能是黃色金針菇風味、口感優于白色金針菇的原因[4]。黃色金針菇外觀深黃、基部褐色重，品相較差，子實體經常出現菌柄向上彎曲、菌蓋開傘、顏色過深等現象，影響了其商品性。目前，黃色金針菇因其出菇不整齊、產量低等問題，未有工廠化生產。為此，筆者進行黃色金針菇與白色金針菇雜交菌株選育，以期篩選適合工廠栽培的淺黃色金針菇品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜交親本：黃色金針菇品種“新蘇6”（XS6），為提純復壯菌株，具有高產、早熟、抗逆性強的特點；白色金針菇品種“金雜15”（Z15），為抗病性較強的雜交新菌株。以上菌株均為河北省科學院生物研究所提供。

病原菌：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），河北省科學院生物研究所分離。

PDA培養基為馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。谷粒母種培養料配方為谷子99 g，石膏1 g。含水量58%，pH自然。

栽培培養料配方為木屑30%，玉米芯20%，棉籽殼20%，麩皮15%，米糠15%。料含水量65%，pH自然。

1.2 選育方法

1.2.1 單核菌株分離篩選

分別取兩親本菇形完整、長勢旺盛、接近成熟的子實體，于無菌環境下剪去菌柄，將有菌褶一面平貼在滅菌平皿上，過夜，收集孢子[5]。用無菌水稀釋孢子至2×104個/mL（血球計數板法），取50μL孢子液涂布于PDA平板中，25℃黑暗中倒置培養6～7 d，在平板上肉眼可見微小菌落后，用接種針挑單個菌落轉接于PDA平板上，繼續培養。在菌落外緣挑小菌絲塊壓水玻片于400倍顯微鏡下觀察菌絲有無鎖狀聯合，菌絲無鎖狀聯合的為所需單核菌株。在4℃條件下保存備用[6]。

1.2.2 單核菌株雜交配對

選取生長旺盛的兩親本單核菌株，在PDA培養基中進行兩兩相互配對雜交，25℃培養10～15 d。取菌絲刮片，400倍顯微鏡下觀察有否鎖狀聯合。將具有鎖狀聯合的雜交雙核菌株，轉入PDA試管，25℃培養，備用（即篩選出的供試雜交菌株，下同）。

1.2.3 雜交菌株特性考察

1.2.3.1 菌絲生長速度測定

使用直徑90 mm的培養皿，每皿用定量蠕動泵加入35 mL PDA培養基。在培養皿平板中心接入供試雜交菌株，25℃培養菌絲滿皿后，用直徑為0.5 cm的打孔器打孔制備菌餅。將菌餅接入PDA培養基平板中央，置于25℃恒溫培養箱中培養，每個處理設3個重復。3 d后劃線，記錄菌絲生長天數和測菌落半徑，計算菌絲生長速度。以親本為對照。

1.2.3.2 抗銅綠假單胞菌能力測定

使用直徑90 mm的培養皿，每皿用定量蠕動泵加入35 mL PDA培養基。在培養皿平板中心接入供試雜交菌株，25℃培養滿皿后，用直徑為0.5 cm的打孔器打孔制備菌餅；同時活化銅綠假單胞菌菌種。將制備的菌餅接種到距離平板中心1.75 cm處，對稱接入銅綠假單胞菌，在25℃條件培養7 d。觀察記錄菌絲生長及拮抗情況，測量拮抗線的寬度[7]。以親本為對照。

1.2.3.3 出菇試驗

出菇試驗在臨西縣天和食用菌開發有限公司[8]。將供試雜交菌株及親本菌株接入谷粒母種培養基，25℃培養15 d制成母種。將母種接入裝有滅菌栽培料的1100 mL規格塑料瓶中，每瓶裝濕料約750 g，每個菌株重復16瓶。前期培養溫度18～20℃，后期培養溫度12～16℃，空氣相對濕度55%～65%；待菌絲長滿栽培瓶后，刮除瓶口表層菌絲進行搔菌；搔菌后的栽培瓶移入出菇房，初始溫度17℃，維持5 d，然后逐步降低溫度，原基形成后，保持溫度8～10℃，空氣相對濕度85%～95%，CO22000 mg/kg。當子實體高出瓶口2～3 cm時套筒，每天150 lx光照8 h，連續光照2 d，CO22000～9000 mg/kg，待菌柄長至16～18 cm采收。統計子實體分枝數、測產量，觀察記錄子實體顏色。

1.2.4 菌株的ITS鑒定

采用真菌ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對樣品進行擴增。PCR反應體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTP、引物分別加入0.5μL、0.5μL Taq DNA 聚合酶、0.5μL DNA模板，用水補至25μL。PCR擴增條件：94℃2 min，94℃ 40 s，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環，72℃5 min，將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[9]。采用PCR純化試劑盒EP101（北京全式金生物科技有限公司）對擴增產物進行純化。采用試劑盒CT301（北京全式金生物科技有限公司）將純化后的PCR產物連接T3載體，挑陽性克隆接種于液體LB培養基中培養6 h，驗證陽性克隆，將陽性克隆菌液送至華大基因進行測序，所得序列與NCBI數據庫中已知序列進行比對，采用MEGA 6軟件，通過臨近法構建系統發育樹。

1.2.5 數據處理

采用Excel2007處理數據，獲得均值及標準差。采用SPSS2.0軟件中Duncan檢驗方法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 雜交結果

從黃色金針菇“新蘇6”中分離鑒定出單孢菌株15個，白色金針菇“金雜15”中分離鑒定出單孢菌株5個。進行兩兩相互配對雜交，共配對雜交組合75個，以鎖狀聯合為標記鑒定雜交菌株，確定雜交菌株37個，雜交成功率為49.3%。

2.2 雜交菌株特性

對37個雜交菌株菌絲生長速度測定和抗病原銅綠假單胞菌能力測定，其中生長速度顯著高于親本的雜交菌株有13個，詳見表1。由表1可知，病原銅綠假單胞菌可以強烈抑制金針菇菌絲的生長，拮抗帶越窄金針菇抗性越強（圖1）。菌絲生長速度快的13個菌株，抗病原銅綠假單胞菌能力均強于親本，排在前5位的分別為F9、F2、F14、F6和F1。

表1 親本與雜交菌株菌絲長速及抗菌能力

2.3 出菇試驗結果

13個雜交菌株工廠化栽培出菇試驗結果見表2。由于生理“吐水”嚴重，出菇過程中采取了3次倒水操作，F6和F12由于“吐水”過多，未能正常出菇。由表2可知，雜交菌株子實體均為黃色，其中8個菌株子實體顏色較黃色親本“新蘇6”顏色淺。產量處前3名的雜交菌株為F1、F17和F9，分別為296 g/瓶、278 g/瓶和271 g/瓶，分別比親本“新蘇6”提高39.6%、31.1%和27.8%。從吐水量和產量關系看（圖3、表2），除F8以外，吐水量和產量呈負相關。

圖1 親本和4個雜交菌株與病原銅綠假單胞菌拮抗情況

圖2 雜交菌株子實體

表2 雜交菌株出菇情況

2.4 菌株ITS真實性分析

圖3 金針菇產量和“吐水”量比較

ITS序列是真菌基因組rDNA的內轉錄間隔區，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之間，在物種屬內、近緣屬間乃至科內系統進化關系研究中有一定的價值。采用ITS1和ITS4引物序列對篩選出的金針菇雜交菌株及親本進行PCR擴增，獲得大小為823～844 bp的片段（圖4）。選擇Lentinula edodesL9作為外圍，如圖5所示，F1與F17親緣關系最近，F9與F1、F17、F33親緣關系次之，選育出的金針菇F1、F17、F9菌株與親本Z15和XS6并未聚集在一類，為不同于親本的新菌株。

圖4 金針菇雜交菌株及親本的ITS電泳

圖5 基于ITS序列構建的金針菇的系統發育樹

3 小結與討論

出菇試驗發現，黃色金針菇和白色金針菇在菌絲生長階段的差異主要為：黃色金針菇在栽培料中菌絲生長粗壯，生長快，搔菌后至原基形成階段易出現生理“吐水”現象。工廠化立瓶栽培金針菇，出現“吐水”過多，會把剛形成的原基淹沒，導致原基缺氧死亡。因此，筆者認為嚴重的生理“吐水”現象是黃色金針菇工廠化栽培不成功原因之一。

試驗選育出的大多數雜交菌株子實體顏色比黃色親本淺（圖2），抗病原銅綠假單胞菌能力、產量介于兩個親本之間，同時發現產量與“吐水”量大體呈負相關；篩選出的F1、F17及F9雜交菌株子實體顏色淺黃，抗性強，“吐水”少，產量高于黃色金針菇親本。試驗為進一步雜交選育適宜工廠化栽培產量高、品質好黃色金針菇奠定了基礎。