食品級重組產朊假絲酵母菌的構建及其遺傳穩定性測定

其布日，薩初拉，蘇少鋒，高 娃，王蘊華，劉紅葵，吳青海，呼 和

（內蒙古自治區農牧業科學院生物技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010031）

目前絕大多數的酵母表達載體都將大腸桿菌來源的抗性標記和大腸桿菌復制區整合到酵母基因組上，這對于食品安全而言是不利的[1-2]。食品級基因工程表達系統是指其宿主及表達載體為食品工業領域認可的、安全完整的表達系[3]。構建食品級表達系統時用到的宿主菌必須是食品級微生物GRAS，試驗材料、抗性標記等都應對環境及人體無毒害作用[4]。食品級工程菌株不能含有非食品級菌種來源的功能性DNA片段[5]。構建食品級表達系統一般有3種方法。第1種方法是通過共轉化構建食品級表達載體，即用2種載體：一種是能在宿主菌中復制的載體，另一種是帶有抗性標記卻不含復制區的伴侶載體，將這2種載體共同轉化至宿主菌后，通過表型選擇和傳代培養獲得不含抗性標記的轉化子。第2種方法是采用非抗生素抗性選擇標記來構建食品級表達載體[6-8]。第3種方法是通過同源重組來構建食品級表達系統，構建載體時會有一些異源微生物的序列，可通過基因工程手段，例如重疊延伸PCR方法刪除異源序列，然后將食品級表達系統整合到宿主菌株染色體上，構建食品級載體[9-10]。

重疊延伸PCR方法 （gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR），即利用具有互補末端的引物，使PCR產物出現重疊鏈，通過重疊鏈延伸使不同來源的2條鏈完成拼接[11]。該方法不用酶切連接處理，引物只要與模板結合，使2段基因出現1個重疊區域，用重疊區域的長引物序列形成重疊鏈，使基因拼接或重組。SOE-PCR技術在基因點突變、基因敲除、大片段的插入及刪除[12]、基因融合等方面有廣泛的應用[13-15]。該研究利用SOE-PCR技術將實驗室構建的醇溶蛋白基因（zein）酵母表達載體PGZM18中的包括抗藥性標記Amp在內的細菌質粒序列DNA片段刪除后，重新拼接構建食品級酵母載體。在SOE-PCR中，2個重疊的DNA片段是分別從2個獨立的PCR擴增反應得到的，混合2次PCR產物，由于2個突變端引物有重疊區，重疊片段之間退火、延伸成異源雙鏈，加入外側引物進行第2次PCR，即可得到目標重組體。設計引物時需考慮重疊部分的長度以及幾組引物的Tm值相近度，以便第2步混合模板PCR基因融合擴增順利進行[16-17]。

表1 SOE-PCR引物序列

載體中原核基因序列刪除后，將真核基因轉化至被FDA認定為食品級微生物的產朊假絲酵母中構建食品級工程菌株。由于外源基因轉化到宿主中經過多次傳代培養易出現外源基因丟失現象，因此，該研究進一步對重組酵母菌株進行了外源基因遺傳穩定性的測定。通過開展食品級重組產朊假絲酵母菌的構建及其遺傳穩定性的評價，以期為飼料工業中食品級酵母工程菌株的構建以及利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒載體：PGZM18原核載體由筆者所在的實驗室構建保存；產朊假絲酵母菌株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC 1769。

1.1.2 主要試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris-堿）、甘氨酸、胰化蛋白胨、酵母提取物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；試驗中用到的內切酶、DNA Marker購寶生物工程（大連）有限公司；DNA回收試劑盒 （E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit）購自OMEGA公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計與合成：分析載體質粒序列真核及原核基因部分，以PGZM18原核載體質粒（見圖1）為模板，根據參考文獻[17]進行引物設計，相關引物序列見表1。

圖1 pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA（PGZM18）載體質粒圖譜

1.2.2 擴增P1-1和P2-1基因片段：以PGZM18載體質粒為模板進行引物設計，分別以P1-1S、P1-1AS和 P2-1S、P2-1AS為引物，進行 A、B 2組PCR試驗。A組PCR反應條件：94℃預變性1 min；98℃變性 10 s，60℃退火 15 s，68℃延伸 6 min，共30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。B組PCR反應條件：94℃預變性 1 min；98℃變性10 s，60℃退火 15 s，68℃延伸 1 min， 共 30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。A、B 2組各取5 μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠（含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統觀察結果，并用DNA回收試劑盒回收目的產物，A、B 2組的PCR產物片段大小分別約為5 085 bp和350 bp。

1.2.3 P1-1和P2-1 2個基因片段的拼接：將P1-1和P2-1 PCR回收產物混合為模板，以P1-1S、P2-1AS作為上、下游引物進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性1 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸6 min，共30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。將混合PCR回收產物命名為Mix1（見圖2），并將PCR產物送測序。

圖2 SOE-PCR引物設計以及刪除原核序列后的GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）結構示意圖

1.2.4 刪除原核DNA序列后轉化至酵母菌株

1.2.4.1 酵母感受態細胞的制備：將保存于-80℃的產朊假絲酵母進行復蘇，在YPD固體培養基中30℃培養2～3 d。選擇1個單克隆接種于3 mL YPD培養基中，于30℃條件下50 r/min振蕩培養8 h。從上一步取5 μL菌液加入50 mL YPD培養基中進行培養，直到菌液OD值達到0.15～0.30（培養16～20 h）。將菌液倒入50 mL離心管中進行離心，棄掉上清液，用新的100 mL YPD培養基重懸沉淀物，然后再進行搖菌培養，直到菌液OD值達到 0.4～0.5（培養 3～5 h）。 將 100 mL 菌液分裝到 2個50 mL離心管中離心，棄掉上清液，用30 mL滅菌水重懸，室溫離心5 min，棄上清液，加入1.5 mL 1.1×TE/LiAc重懸細胞。將重懸液轉到1.5 mL離心管中高速離心15 s，棄上清液，加入600 μL 1.1×TE/LiAc重懸細胞，然后進行PCR產物轉化。

1.2.4.2 酵母轉化試驗：在反應管中加入PCR產物 Mix1 （100 ng/μL）、Yeastmaker Carrier DNA（10 μg/μL）5 μL、酵母感受態細胞 50 μL，輕輕混勻，然后加入500 μL PEG/LiAC輕輕混勻，30℃培養30 min，每隔10 min輕輕混勻1次。加入20 μL DMSO混勻，42℃水浴15 min，每隔5 min輕輕混勻1次，然后高速離心30 s。加入1 mL YPD Plus Medium，30℃培養 90 min，高速離心 30 s，棄上清液，加入1 mL 0.9%NaCl溶液重懸，然后涂布于YPD/CYH（20 μg/mL）平板上，30 ℃培養 3～5 d。

1.2.4.3 酵母重組子的基因組PCR鑒定：對上一步生長在YPD/CYH（20 μg/mL）平板上的重組酵母菌提取基因組，以酵母基因組為模板，設計3組不同的引物鑒定陽性克隆，分別為 Z1、Z2，3S、3AS，5S、5AS。

①根據外源目的基因序列zein設計的引物：引物Z1、Z2的序列及擴增目的片段大小見表2。PCR反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 1 min， 共 30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。 取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠（含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統觀察結果。

②根據載體序列GAP-zein-mL41（GZM）設計的引物：引物3S、3AS的序列及擴增目的片段大小見表3。PCR反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 4 min， 共 30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠 （含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統觀察結果。

③根據載體序列GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）設計的引物：引物5S、5AS的序列及擴增目的片段大小見表4。PCR反應條件為：94℃預變性 2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸5 min，共30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR產物用 1%瓊脂糖凝膠 （含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統觀察結果。

1.2.5 外源基因遺傳穩定性測定

1.2.5.1 酵母菌落計數：將酵母重組子接種于5 mL YPD培養基中，于28℃條件下100 r/min振蕩培養24 h。取1 mL菌液用生理鹽水稀釋105倍，分別取100 mL菌液涂布于YPD（不含CYH）和 YPD/CYH （20 μg/mL）2 種固體培養基上，28 ℃培養24 h，第2天（記為Day 1）分別計數2種平板上形成的菌落數，YPD（不含CYH）固體培養基的菌落計數結果以 A1 表示，YPD/CYH（20 μg/mL）固體培養基的菌落計數結果以A2表示。將菌液接種于新鮮YPD培養基中，每隔24 h轉接1次，連續轉接15次，使總的繁殖時間為360 h。每次轉接前測定菌液OD600nm值，測定結果以N表示。每次轉接后的初始OD600nm值為0.1左右，以使其一直處于生長狀態。轉化子經過360 h（記為Day 15）生長后進行菌落計數，用同樣的方法稀釋菌體細胞，并分別涂布于上述2種固體培養基上，待長出單菌落后，菌落計數結果分別以B151和B152表示。質粒穩定性的計算公式為：A2×B151/A1×B152[18-19]。

表2 zein基因引物信息

表3 GAP-zein-mL41（GZM）引物信息

表4 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）引物信息

圖3 引物P1-1和P2-1 PCR產物電泳檢測結果

圖4 zein基因的PCR鑒定結果

圖5 GAP-zein-mL41（GZM）PCR鑒定結果

1.2.5.2 酵母基因組PCR檢測：將酵母重組子用上一步的培養方法，分別用YPD（不含CYH）和YPD/CYH（20 μg/mL）2 種固體培養基進行接種傳代培養后，選取第1、7、15天的酵母菌培養物提取酵母基因組，利用PCR檢測目的基因，測定外源基因遺傳穩定性[20]。

2 結果與分析

2.1 P1-1和P2-1 2個基因片段擴增PCR產物鑒定結果

分別利用 P1-1S、P1-1AS 和 P2-1S、P2-1AS引物進行A、B 2組PCR試驗。由圖3可知，獲得的P1-1和P2-1產物片段大小分別為5 085 bp和350 bp左右，與預期擴增大小相符。

圖6 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）PCR 電泳圖

2.2 P1-1和P2-1拼接產物的鑒定結果

將P1-1和P2-1的PCR回收產物混合為模板，以P1-1S和P2-1AS分別作為上、下游引物進行PCR試驗。獲得的P1-1和P2-1拼接產物Mix1的片段大小為5 396 bp。對PCR產物進行測序，結果表明，Mix1的序列與預測的載體真核序列完全一致，表明原核基因序列刪除，食品級序列拼接成功。

2.3 酵母重組子鑒定結果

以酵母重組子基因組為模板進行PCR鑒定。zein基因引物Z1、Z2的PCR產物大小為453 bp（見圖 4），載體序列 GAP-zein-mL41（GZM）引物3S、3AS 的 PCR 產物大小為 3 620 bp（見圖 5），載體序列 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）引物5S、5AS的PCR產物大小為4 446 bp（見圖6）。

2.4 外源基因遺傳穩定性測定結果

2.4.1 菌落計數方法檢測遺傳穩定性：外源基因在宿主產朊假絲酵母基因組上的遺傳穩定性檢測結果見圖7，不同培養時間及不同培養基中的酵母菌落計數結果見表5。由表5可知，整合型重組質粒在酵母的基因組中有良好的穩定性，培養100代左右，外源基因在重組酵母中仍能夠穩定存在。根據表5中列出的相關數據，利用上述質粒穩定性計算公式，得到質粒穩定性結果為0.93。

2.4.2 PCR檢測目的基因鑒定遺傳穩定性：提取重組酵母基因組DNA，利用zein基因引物進行PCR擴增。由圖8可知，目的基因穩定存在，在酵母菌傳代100代時仍含有目的條帶，表明外源基因沒有丟失，在傳代培養過程中保持了較高的遺傳穩定性。

3 討論與結論

該研究利用SOE-PCR技術，刪除原有載體PGZM18中包含抗藥性標記Amp在內的細菌質粒序列DNA片段及原核復制區序列；將真核基因序列通過同源重組技術轉化至產朊假絲酵母染色體中；重組酵母菌株經過多次傳代培養，通過菌落計數和外源基因PCR方法鑒定整合到染色體上的外源基因具有較好的遺傳穩定性，從而獲得遺傳穩定的食品級酵母工程菌株。食品級基因工程菌在工業生產的應用日益增多，而在食品、醫藥、飼料等領域的應用則需要更安全的食品級工程菌株。然而，構建的食品級工程菌株能否最終應用于工業領域，使重組酵母菌株進行大規模的培養以及外源基因的大量表達等還需更多的深入研究。

圖7 遺傳穩定性試驗中不同培養時間及不同培養基中的酵母菌落生長情況

圖8 外源基因zein遺傳穩定性PCR檢測結果

表5 不同培養時間及不同培養基中的酵母菌落計數結果