黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中抗壞血酸含量及相關(guān)酶活性的變化

孫小娟，劉慶帥，員盎然，張妍，霍俊偉，秦棟，姜婷

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黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中抗壞血酸含量及相關(guān)酶活性的變化

孫小娟，劉慶帥，員盎然，張妍，霍俊偉，秦棟，姜婷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/寒地小漿果開(kāi)發(fā)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，哈爾濱 150030）

【目的】研究不同品種不同生長(zhǎng)時(shí)期黑穗醋栗果實(shí)內(nèi)抗壞血酸（AsA）含量及其合成代謝過(guò)程中相關(guān)酶活性的變化，以明確果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA含量與代謝合成相關(guān)酶之間的關(guān)系，為全面揭示黑穗醋栗果實(shí)AsA積累規(guī)律提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?個(gè)不同黑穗醋栗品種（‘亞德’‘布勞德’和‘黑豐’）為試材，測(cè)定果實(shí)在幼果期、膨大期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期和成熟期時(shí)還原型抗壞血酸（AsA）、氧化型抗壞血酸（DHA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及AsA合成與代謝相關(guān)酶活性。【結(jié)果】不同品種黑穗醋栗果實(shí)大小、AsA含量以及AsA相關(guān)代謝物水平存在明顯的多樣性。其中‘亞德’單果重最大，為1.97 g。果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，總抗壞血酸（T-AsA）和AsA含量在3個(gè)品種中變化趨勢(shì)一致，均在幼果期含量最高，其中‘亞德’幼果期果實(shí)中AsA含量最高，為83.17 μmol·g-1FW，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)迅速下降，在成熟期降至21.28 μmol·g-1FW；3個(gè)品種果實(shí)中GSH和T-GSH含量隨著果實(shí)發(fā)育呈升高趨勢(shì)，但不同品種升高時(shí)期或增加幅度不同；GSSG含量在不同品種間存在較大差異，成熟果中‘黑豐’含量最低，為0.008 μmol·g-1FW，僅為‘亞德’的10.2%。AsA-GSH循環(huán)再生代謝中，脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性在果實(shí)膨大期達(dá)到最高，成熟期降至最低，其中‘布勞德’果實(shí)中DHAR和MDHAR活性略高于‘亞德’和‘黑豐’；谷胱甘肽還原酶（GR）活性在幼果期最高，‘亞德’幼果期果實(shí)中GR活性最高（0.06 μmol·min-1·g-1FW），之后隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育不斷下降，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性變化與之相似；L-半乳糖途徑的關(guān)鍵酶L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）活性隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的變化趨勢(shì)與AsA含量變化相一致，且‘亞德’果實(shí)中GalLDH活性在幼果期和成熟期均高于其他兩個(gè)品種。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，GalLDH與T-AsA、AsA、DHA、DHAR和MDHAR呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.91以上，即果實(shí)中GalLDH活性越高，果實(shí)中AsA含量也越高；DHAR和MDHAR與T-AsA、AsA間也存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，而APX與T-GSH、GSH間相關(guān)性較強(qiáng)。【結(jié)論】黑穗醋栗幼果期果實(shí)中AsA含量最高，且品種間差異顯著；GalLDH、MDHAR和DHAR可能是黑穗醋栗果實(shí)中AsA合成代謝的關(guān)鍵酶，黑穗醋栗果實(shí)中AsA含量積累主要取決于GalLDH活性，說(shuō)明合成途徑起著更關(guān)鍵的作用，而AsA-GSH循環(huán)再生途徑相關(guān)酶對(duì)AsA合成也有一定的貢獻(xiàn)，黑穗醋栗高AsA含量的積累是由合成途徑與循環(huán)途徑共同作用的結(jié)果。

黑穗醋栗；果實(shí)；抗壞血酸；合成；L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶

0 引言

【研究意義】黑穗醋栗（L.）屬虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子屬（）落葉叢生灌木[1]，果實(shí)為黑色漿果，近球形，味酸甜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[2-3]，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的寒地小漿果[4]。黑穗醋栗以富含高水平的抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）而著稱，鮮果中AsA含量高達(dá)11.36—22.73 μmol?g-1FW[5]，僅次于獼猴桃，是重要的AsA植物源。AsA含量的高低是衡量與評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)高低的重要指標(biāo)之一，研究黑穗醋栗果實(shí)在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中AsA積累量與關(guān)鍵酶活性的變化，對(duì)闡明黑穗醋栗AsA的合成與積累機(jī)制及培育高AsA含量的品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】幾乎所有的新鮮蔬菜和水果都含有AsA[6-7]。AsA作為抗氧化劑和酶輔助因子在植物的多數(shù)生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[8]，在維持人體健康，降低慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)[9-11]，促進(jìn)膠原蛋白形成和骨骼發(fā)育等方面也有重要的醫(yī)療價(jià)值[12-13]，因此，AsA在植物中的合成與代謝備受重視。植物中AsA的合成途徑主要有4條，其中刺梨[14]、獼猴桃[15]和蘋(píng)果[16]等大多數(shù)植物的主要合成途徑為L(zhǎng)-半乳糖途徑，L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）是催化AsA合成的最后一步關(guān)鍵酶[8]?？箟难?谷胱甘肽（AsA–GSH）循壞再生途徑對(duì)AsA含量也有一定影響[17]，植物體內(nèi)AsA最終含量受合成和循環(huán)再生的調(diào)控[18]。臍橙[19]果皮中AsA含量積累主要取決于GalLDH活性，而果肉中AsA含量可能取決于AsA的再生循環(huán)系統(tǒng)。已有研究表明黑穗醋栗果實(shí)中AsA積累主要是通過(guò)原位生物合成[20]，黑穗醋栗不同品種成熟期果實(shí)AsA含量不同，差異明顯，并且對(duì)其植株進(jìn)行摘葉摘果處理后發(fā)現(xiàn)，果實(shí)中AsA含量變化幅度較小[21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)獼猴桃[22]、蘋(píng)果[23]、甜櫻桃[24]和刺梨[25]等果實(shí)中AsA含量以及相關(guān)的研究已經(jīng)較為深入。而有關(guān)黑穗醋栗AsA含量研究?jī)H限于測(cè)定不同品種果實(shí)中的總含量[20,26]，對(duì)黑穗醋栗不同品種各個(gè)發(fā)育階段果實(shí)中AsA含量水平，以及影響不同品種AsA合成積累的關(guān)鍵酶活性還未有過(guò)系統(tǒng)分析，對(duì)其AsA合成再生途徑及調(diào)控AsA代謝機(jī)理的研究還不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】筆者課題組前期研究表明，不同品種黑穗醋栗成熟期果實(shí)AsA含量及AsA合成相關(guān)酶活性差異較大[26]。為探明差異的原因，進(jìn)一步研究黑穗醋栗果實(shí)內(nèi)AsA的代謝機(jī)理，本試驗(yàn)選取3個(gè)不同品種的黑穗醋栗果實(shí)，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期果實(shí)內(nèi)的AsA含量及相關(guān)酶活性進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)分析AsA合成及循環(huán)再生代謝的相關(guān)酶活性，研究黑穗醋栗AsA積累的機(jī)理，為培育更優(yōu)質(zhì)的品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑穗醋栗種質(zhì)資源圃進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為3個(gè)不同黑穗醋栗主栽品種‘亞德列娜亞（以下均簡(jiǎn)稱亞德）’（Adelinia）、‘布勞德’（Brodtrop）和‘黑豐’（Heifeng），10年生，株行距為1.2 m×1.5 m，常規(guī)管理。

根據(jù)果實(shí)的大小和顏色（圖1），在幼果期、膨大期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期和成熟期采樣，采樣時(shí)間為2016年5—7月和2017年5—7月，選取2016和2017年的數(shù)據(jù)均值分析。測(cè)試樣品每3棵一次重復(fù)，3次重復(fù)，每次從不同單株的不同部位均勻采集≥30個(gè)果實(shí)，新鮮果實(shí)采后迅速放入冰盒，帶回試驗(yàn)室計(jì)數(shù)、游標(biāo)卡尺測(cè)量及稱重后用刀切碎混合，立即用液氮速凍，分裝保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定AsA合成代謝相關(guān)酶活性。

A：亞德Adelinia；B：布勞德Brodtrop；C：黑豐Heifeng。下同 The same as below

1.2 果實(shí)單果重及橫縱徑測(cè)定

單果鮮重：用電子天平稱取，結(jié)果精確到化0.01 g。

果實(shí)橫縱徑：采用游標(biāo)卡尺測(cè)量，結(jié)果精確到0.01 mm。以上單果鮮重和果實(shí)橫縱徑全部觀測(cè)完成后，根據(jù)每次觀測(cè)記錄的平均值，繪制果實(shí)生長(zhǎng)曲線。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

還原型抗壞血酸（AsA）、氧化型抗壞血酸（DHA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的測(cè)定試劑盒及脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）和L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）活性的試劑盒購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取、測(cè)定。其中總抗壞血酸（T-AsA）含量為AsA與DHA之和，總谷胱甘肽（T-GSH）含量為GSH與GSSG之和。以上測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖，以SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)

隨著果實(shí)的發(fā)育，3個(gè)品種果實(shí)單果重和橫、縱徑均呈明顯的上升趨勢(shì)，其中膨大期上升幅度最大（圖2）。3個(gè)品種成熟果中，以‘亞德’的果實(shí)最大，單果重、橫徑、縱徑均最大，分別達(dá)到1.97 g、14.28 mm、15.17 mm，‘布勞德’次之，‘黑豐’果實(shí)最小，分別為0.98 g、12.03 mm、12.72 mm，‘黑豐’單果重僅為‘亞德’的50.25%。

2.2 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA、DHA及T-AsA含量的變化

3個(gè)品種果實(shí)中T-AsA、AsA和DHA含量在整個(gè)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中變化相似，均呈下降趨勢(shì)（圖3），其中在果實(shí)的幼果期至膨大期，果實(shí)AsA含量下降較快，‘亞德’‘布勞德’和‘黑豐’分別下降57.11%、26.95%和33.31%，而3個(gè)品種果實(shí)成熟期的AsA含量分別為幼果期的25.59%、37.67%和33.62%。‘亞德’成熟期果實(shí)中AsA含量最高，為21.28 μmol?g-1FW，分別是‘布勞德’和‘黑豐’的1.39倍和2.18倍，這進(jìn)一步證實(shí)了黑穗醋栗品種果實(shí)AsA含量具有多樣性。3個(gè)品種的黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中抗壞血酸主要以還原態(tài)的AsA的形式存在，‘亞德’成熟果中DHA含量只達(dá)到AsA的21.38%。

同一品種內(nèi)中不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

The different letters in the same cultivar showed significant difference (＜0.05). The same as below

圖2 黑穗醋栗果實(shí)單果重及橫縱徑變化

Fig. 2 Changes of single fruit weight, horizontal diameter and vertical diameter of black currant

圖3 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中T-AsA、AsA和DHA含量的變化

2.3 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GSH、GSSG及T-GSH含量的變化

3個(gè)品種GSH和T-GSH含量在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出明顯的差異，隨著果實(shí)發(fā)育呈升高趨勢(shì)，但不同品種升高時(shí)期或增加幅度不同（圖4）。‘亞德’中GSH和T-GSH含量變化呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，均在果實(shí)幼果期處于最低水平，分別為0.10和0.19 μmol?g-1FW，隨著果實(shí)進(jìn)入膨大期，GSH和T-GSH含量急劇增加，并在果實(shí)半轉(zhuǎn)色期達(dá)到峰值，分別為幼果期的3.37倍和5.3倍，之后在轉(zhuǎn)色期略有下降，而在果實(shí)成熟期回升至與半轉(zhuǎn)色期基本持平?！紕诘隆汀谪S’中GSH和T-GSH含量變化模式相似，總體上均呈“M”型變化趨勢(shì)。果實(shí)GSH和T-GSH含量也是在幼果期最低，不同的是在半轉(zhuǎn)色期含量較低，而在轉(zhuǎn)色期快速增加至最大值（圖4-A、C）。

3個(gè)品種GSSG含量變化趨勢(shì)有所差異，其中‘亞德’和‘布勞德’呈先上升后下降的趨勢(shì)，而‘黑豐’GSSG含量一直處于下降。‘亞德’和‘布勞德’成熟果中GSSG含量相差不大，分別為0.078和0.071 μmol?g-1FW，而‘黑豐’成熟果中含量較低，為0.008 μmol?g-1FW，僅為‘亞德’的10.2%（圖4-B）。

2.4 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA-GSH氧化還原程度

AsA/DHA的大小代表了AsA氧化還原程度的高低，比值越高，則還原態(tài)的AsA含量越高，對(duì)AsA的積累越有利。3個(gè)品種AsA/DHA值隨著果實(shí)的發(fā)育，均呈先下降后上升的趨勢(shì)（圖5），其中‘亞德’果實(shí)中AsA/DHA值較高，說(shuō)明‘亞德’中AsA氧化程度較高。‘亞德’和‘布勞德’果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育前期，AsA/DHA逐漸降低，均在果實(shí)膨大期降至最低，分別為2.82、1.93，在果實(shí)半轉(zhuǎn)色期和轉(zhuǎn)色期持續(xù)增加，在果實(shí)轉(zhuǎn)色期達(dá)到最大值，分別為果實(shí)膨大期的1.71和1.35倍，之后在果實(shí)成熟期緩慢降低，但品種內(nèi)差異不顯著（圖5）。而‘黑豐’果實(shí)中的AsA/DHA比值在果實(shí)半轉(zhuǎn)色期降低至最低值（1.45），果實(shí)成熟期的AsA/DHA值為果實(shí)半轉(zhuǎn)色期的1.39倍。

圖4 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中T-GSH、GSH和GSSG含量的變化

圖5 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA/DHA和GSH/GSSH值的變化

GSH/GSSG值用來(lái)衡量谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)，通常使用GSH/GSSG值來(lái)反應(yīng)AsA-GSH循環(huán)在AsA生成中所起的重要作用。3個(gè)品種GSH/GSSG值變化趨勢(shì)有所不同（圖5），隨著果實(shí)的發(fā)育，在‘亞德’和‘黑豐’中總體呈上升趨勢(shì)，而‘布勞德’在果實(shí)半轉(zhuǎn)色期有一個(gè)明顯的下降趨勢(shì)。在‘亞德’和‘黑豐’果實(shí)的整個(gè)發(fā)育時(shí)期，GSH/GSSG值均在幼果期最低，之后持續(xù)提高，說(shuō)明此時(shí)GSH含量呈上升趨勢(shì)，再生能力增強(qiáng)，合成能力有所減緩，在果實(shí)成熟期達(dá)到最大，分別為果實(shí)幼果期的6.54倍和2.81倍?！紕诘隆蠫SH/GSSG值在半轉(zhuǎn)色期最低，之后迅速上升，至成熟期達(dá)到9.27。

2.5 黑穗醋栗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA-GSH循壞代謝相關(guān)酶活性的變化

3個(gè)品種APX活性變化趨勢(shì)基本一致，均在幼果期達(dá)到峰值，此時(shí)‘亞德’‘布勞德’和‘黑豐’APX活性分別為0.85、0.63和0.56 μmol?min-1?g-1FW （圖6-A），到果實(shí)半轉(zhuǎn)色期后3個(gè)品種中APX活性分別降至果實(shí)幼果期的23.73%、25.24%和23.43%，APX活性的降低有助于確保AsA含量的積累與穩(wěn)定。從品種間來(lái)看，‘亞德’果實(shí)中APX活性較高，其他兩個(gè)品種相差不大。

圖6 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA-GSH循環(huán)酶活性的變化

3個(gè)品種果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中DHAR和MDHAR活性總體變化趨勢(shì)基本一致，均呈“M”型的變化（圖6-B、C），即先增加后降低再增加再降低的形式。3個(gè)品種果實(shí)DHAR活性均在果實(shí)膨大期最高，‘亞德’‘布勞德’和‘黑豐’分別為0.32、0.43和0.40 μmol?min-1?g-1FW，之后隨著果實(shí)的生長(zhǎng)而下降，‘布勞德’和‘黑豐’在轉(zhuǎn)色期有輕微的回升，隨后均隨著果實(shí)的成熟降至最低，成熟期酶活性分別比膨大期下降了56.25%、51.16%和42.50%。同時(shí)，3個(gè)品種果實(shí)MDHAR活性均在膨大期達(dá)到峰值，分別為0.14、0.15和0.35 μmol?min-1?g-1FW，在果實(shí)成熟期降到最低值，僅分別為果實(shí)膨大期的6.93%、54.22%和9.11%。相較于DHAR活性大小，不同品種不同時(shí)期果實(shí)中MDHAR活性均明顯低于DHAR活性。

3個(gè)品種果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GR活性均呈下降趨勢(shì)（圖6-D），都表現(xiàn)為幼果期酶活性最高，之后逐漸下降，并于果實(shí)成熟期時(shí)降至最低值，此時(shí)‘亞德’‘布勞德’和‘黑豐’GR活性分別下降至果實(shí)幼果期的12.79%、34.31%和28.92%，‘亞德’GR活性下降幅度最大。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)果實(shí)中GR活性的變化趨勢(shì)與APX的變化趨勢(shì)相似。AsA-GSH循壞代謝相關(guān)酶活性均在果實(shí)幼果期相對(duì)較高，說(shuō)明在黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育初期再生循環(huán)對(duì)AsA含量積累的影響較大。

2.6 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GalLDH活性變化

3個(gè)品種果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GalLDH活性存在明顯的差異（圖7），其中，‘亞德’幼果期GalLDH活性最高。GalLDH的活性變化趨勢(shì)在‘亞德’和‘布勞德’中較為相似，均是在幼果期活性相對(duì)較高，分別為4.07和2.69 μmol?min-1?g-1FW，這也是果實(shí)內(nèi)AsA含量迅速積累的時(shí)期，隨著果實(shí)的發(fā)育，在果實(shí)膨大期迅速下降，之后表現(xiàn)為緩慢下降，并在果實(shí)成熟期降到最低，分別為幼果期的38.1%和35.83%，且GalLDH活性變化趨勢(shì)與果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA含量的變化趨勢(shì)相一致，這說(shuō)明GalLDH在黑穗醋栗果實(shí)AsA合成途徑中起著關(guān)鍵作用。

‘黑豐’果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，GalLDH活性呈 先增加后下降的變化趨勢(shì)，在果實(shí)進(jìn)入膨大期后，GalLDH活性開(kāi)始迅速增加，至半轉(zhuǎn)色期達(dá)到最大值，而在轉(zhuǎn)色期又迅速下降，至成熟期降至最低，為1.45 μmol?min-1?g-1FW，這與另外兩個(gè)品種果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA含量的變化趨勢(shì)存在較大差異。從品種間來(lái)看，‘亞德’GalLDH活性在幼果期和成熟期均高于其他兩個(gè)品種。

圖7 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中GalLDH活性的變化

2.7 黑穗醋栗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA合成代謝相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性

通過(guò)對(duì)果實(shí)（以‘亞德’為例，另外兩個(gè)品種與‘亞德’類似）不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期相關(guān)酶活性和果實(shí)中AsA含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表1），在‘亞德’果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，AsA和GSH的氧化還原狀態(tài)顯示出顯著的一致性，AsA/DHA和GSH/GSSG的相關(guān)系數(shù)為0.918。T-AsA、AsA和DHA含量與GalLDH、MDHAR和DHAR活性分別呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.91以上，與GSSG含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.71以上。GSSG含量與MDHAR酶活性呈顯著正相關(guān)，GSH/GSSG比值與MDHAR和GR活性呈顯著負(fù)相關(guān)。APX與GR之間呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.929，與AsA/DHA、T-GSH、GSH、GSSG和GSH/GSSG呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDHAR呈負(fù)相關(guān)。MDHAR和DHAR兩者之間極顯著正相關(guān)?？梢?jiàn)，AsA合成途徑中的GalLDH，AsA-GSH循環(huán)途徑中的MDHAR和DHAR對(duì)黑穗醋栗果實(shí)AsA含量起了關(guān)鍵作用，其中GalLDH是AsA合成關(guān)鍵酶。而APX對(duì)果實(shí)中的GSH含量有較大的影響。

表1 ‘亞德’果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA合成代謝相關(guān)酶的相關(guān)系數(shù)

*表示顯著水平0.05；**表示顯著水平0.01 * denote significant at 0.05; ** denote significant at 0.01

3 討論

3.1 黑穗醋栗AsA的積累變化

AsA是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，不同物種間其含量差異很大，即使同一物種不同品種間AsA含量也存在差異，這在獼猴桃[18]和油梨[27]上已證明。本研究中發(fā)現(xiàn)‘亞德’成熟果實(shí)中AsA含量最高，分別是‘布勞德’和‘黑豐’的1.39倍和2.18倍。黑穗醋栗果實(shí)中AsA的含量隨著果實(shí)發(fā)育呈相反的變化，在幼果期AsA含量最高，隨著果實(shí)的膨大有一個(gè)明顯的下降趨勢(shì)，這可能是由于果實(shí)細(xì)胞處于快速生長(zhǎng)期，AsA參與細(xì)胞分裂引起的，也可能是這個(gè)時(shí)期的細(xì)胞膨大對(duì)AsA含量起到稀釋作用[25]，這種變化與樹(shù)莓[28]、桃[29]、西印度櫻桃[30]等果實(shí)中AsA積累一致，但與刺梨[14]果實(shí)AsA的積累不同，其在發(fā)育后期才開(kāi)始大量積累AsA，這也反映了不同物種間的差異性。

3.2 黑穗醋栗AsA合成代謝相關(guān)酶活性的變化特征

GalLDH是AsA合成關(guān)鍵酶，在L-半乳糖途徑中直接氧化AsA合成前體L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯，且對(duì)底物具有較強(qiáng)的特異性[18]。對(duì)甜櫻桃[24]、蘋(píng)果[31]和馬鈴薯[32]等研究中發(fā)現(xiàn)GalLDH在AsA合成途徑中起到主導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)煙草過(guò)表達(dá)GalLDH發(fā)現(xiàn)AsA含量顯著提高[33]。本研究結(jié)果顯示，‘亞德’和‘布勞德’在整個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期，GalLDH活性變化趨勢(shì)與AsA含量變化基本一致，而且‘亞德’果實(shí)GalLDH活性明顯高于其他兩個(gè)品種，這也進(jìn)一步證明GalLDH活性的高低可能是影響黑穗醋栗品種間果實(shí)AsA含量差異的重要原因，同時(shí)也解釋了‘亞德’AsA含量高的原因，進(jìn)而推測(cè)GalLDH可能在AsA合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。而‘黑豐’果實(shí)中GalLDH活性變化與AsA含量變化存在差異，可能與AsA-GSH循環(huán)再生途徑相關(guān)酶的代謝調(diào)控相關(guān)，也可能與品種有關(guān)。

植物中AsA含量主要受合成途徑的影響，但再生途徑對(duì)AsA含量也有重要影響，其中AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)是植物中AsA再生的主要途徑[34]。本研究中發(fā)現(xiàn)，黑穗醋栗果實(shí)發(fā)育前期APX活性明顯高于其他酶活性，隨后在果實(shí)膨大期開(kāi)始迅速降低，這與AsA/DHA值之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)，推測(cè)原因可能是果實(shí)發(fā)育前期細(xì)胞分裂活動(dòng)比較旺盛，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，此時(shí)APX以AsA為電子供體清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，這樣可有效防止活性氧對(duì)細(xì)胞的毒害，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[35]。隨后隨著果實(shí)的發(fā)育緩慢下降，在半轉(zhuǎn)色期后其酶活性基本維持在較低的水平，這表明在這一時(shí)間段內(nèi)果實(shí)內(nèi)積累的AsA極少被氧化，從而確保果實(shí)體內(nèi)AsA的積累與穩(wěn)定。而作為電子供體的AsA通過(guò)AsA-GSH循環(huán)，經(jīng)MDHAR和DHAR作用又可以重新生成AsA。在本試驗(yàn)中，DHAR和MDHAR活性與AsA含量變化趨勢(shì)基本一致，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中總體均呈下降的趨勢(shì)，說(shuō)明DHAR和MDHAR活性是影響黑穗醋栗果實(shí)AsA含量的決定因素之一。此外物種的不同，AsA的再生過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶則不同，藍(lán)莓[36]、蘋(píng)果[37]、番茄[38]等研究表明果實(shí)中MDHAR在對(duì)AsA循環(huán)上起更主要的作用，但在刺梨果實(shí)中卻發(fā)現(xiàn)DHAR的表達(dá)和活性變化均要高于MDHAR[14]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，AsA含量較低的‘黑豐’其MDHAR活性在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期內(nèi)均高于‘亞德’，而AsA含量高的‘亞德’其DHAR活性在整個(gè)果實(shí)發(fā)育階段均低于‘布勞德’和‘黑豐’，至于黑穗醋栗果實(shí)內(nèi)DHAR和MDHAR哪個(gè)酶活性更能起決定，仍需進(jìn)一步探究。隨著黑穗醋栗果實(shí)的成熟，果實(shí)GR活性下降，而AsA含量也下降，表明GR活性有利于果實(shí)中AsA的積累。

3.3 黑穗醋栗AsA含量與合成代謝相關(guān)酶的關(guān)系

在越橘[39]、草莓[40]、甜櫻桃[24]、獼猴桃[41]等研究中發(fā)現(xiàn)，DHAR和MDHAR在AsA-GSH循環(huán)中起到關(guān)鍵性作用。本研究結(jié)果表明，‘亞德’果實(shí)中DHAR和MDHAR活性與AsA含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明黑穗醋栗果實(shí)中AsA的再生主要依賴DHAR和MDHAR維持，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DHAR和MDHAR呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明AsA循環(huán)再生酶可能隨著一種酶活性的變化而相應(yīng)變化。近年來(lái)通過(guò)MDHAR和DHAR的表達(dá)來(lái)提高AsA含量已有不少成功的例子。如在煙草植株[42]中超表達(dá)擬南芥葉綠體的MDHAR后，煙草葉片中AsA含量上升2.2倍。而將小麥胞質(zhì)DHAR分別在煙草和玉米中過(guò)量表達(dá)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草和玉米中DHAR活性均增加了32倍，其AsA含量也增加了4倍，不僅對(duì)AsA含量的影響顯著，而且GSH含量與GSH/GSSG的比率也有所增加，說(shuō)明由DHAR過(guò)量表達(dá)引起的AsA含量提高的同時(shí)，GSH的合成也伴隨著增加，這在馬鈴薯[43]中同樣得到了證實(shí)。作為L(zhǎng)-半乳糖途徑中的關(guān)鍵酶GalLDH，它的有無(wú)決定了植物能否自身合成AsA[34]。獼猴桃中AsA含量的積累與GalLDH活性呈顯著正相關(guān)[41]，同樣水稻中GalLDH活性與AsA含量也存在正相關(guān)關(guān)系[44]。本試驗(yàn)3個(gè)品種中，GalLDH與AsA、T-GSH、MDHAR和DHAR均有較高的相關(guān)性，說(shuō)明GalLDH是黑穗醋栗果實(shí)AsA合成代謝的關(guān)鍵酶。這些結(jié)果說(shuō)明，AsA合成能力在維持AsA含量中起著主導(dǎo)作用，但再生能力同時(shí)也具有一定作用，且可能在特定條件和發(fā)育階段對(duì)AsA水平起到主要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

AsA含量在黑穗醋栗不同品種間存在明顯差異，但均隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育呈下降趨勢(shì)。GalLDH、MDHAR和DHAR是黑穗醋栗果實(shí)中AsA合成代謝的關(guān)鍵酶，而APX對(duì)果實(shí)中的GSH含量有較大的影響。黑穗醋栗果實(shí)中AsA含量積累主要取決于GalLDH活性，占主導(dǎo)地位，AsA-GSH循環(huán)再生途徑對(duì)AsA合成也有一定的貢獻(xiàn)，黑穗醋栗高AsA含量的積累是由合成途徑與循環(huán)途徑共同作用的結(jié)果。黑穗醋栗果實(shí)中AsA含量是評(píng)價(jià)和衡量黑穗醋栗果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，相關(guān)研究結(jié)果也為黑穗醋栗資源的評(píng)價(jià)與利用、果實(shí)品質(zhì)改良和新品種選育提供了指導(dǎo)。

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The Changes in the Contents of Ascorbic Acid and the Activities of Related Enzymes in Black Currant Fruits during the Process of Its Growth and Development

SUN XiaoJuan, LIU QingShuai, YUN AngRan, ZHANG Yan, HUO JunWei, QIN Dong, JIANG Ting

(School of Horticulture and Landscape Architecture, Northeast Agricultural University/Small Fruit Development and Utilization of National Local Joint Engineering Research Center in Cold Region, Harbin 150030)

【Objective】The changes in the ascorbic acid (AsA) contents and the enzymatic activities during the anabolic process of different cultivars and growth stages of black currant fruits were studied to determine the relationship between AsA contents and anabolic enzymes during the growth and development of fruits, so as to provide a theoretical basis for comprehensively revealing the accumulation rule of AsA in black currant fruits. 【Method】Three different cultivars of black currant fruits (Adelinia, Brodtrop and Heifeng) were studied and determined the contents of reduced AsA, oxidized ascorbic acid (DHA), reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) and anabolic enzymatic activities of young, expansion, half-veraison, veraison and maturity stages. 【Result】There were significant diversities in fruit sizes, AsA contents and AsA metabolites of different cultivars of black currant fruits. The Adelinia had the largest weight of single fruit (1.97 g). During the growth and development process of fruits, the changes in the total ascorbic acid (T-AsA) and AsA contents of fruits were consistent among the three cultivars, and the young fruits had the highest contents. The AsA content of young Adelinia fruit was the highest (83.17 μmol?g-1FW) and then sharply decreased rapidly to the maturity stage with the growth of the fruit, which decreased to 21.28 μmol?g-1FW at maturity stage. The contents of GSH and T-GSH in the three cultivars increased with the development of fruits, but the different cultivars increased in different stages and degrees. The content of GSSG was quite different among different cultivars. For the mature fruits, the GSSG content of Heifeng was the lowest, which was 0.008 μmol?g-1FW and only accounted for 10.2% of Adelinia. In AsA-GSH recycling regeneration metabolism, the activities of dehydroascorbate reductase (DHAR) and monodehydroascorbate reductase (MDHAR) showed the highest level at expansion period, and finally decreased to the lowest level at maturity stage. The DHAR and MDHAR activities of Brodtrop fruits showed slightly higher than those of Adelinia and Heifeng fruits. The activity of glutathione reductase (GR) was the highest level at young stage. The GR activity of Adelinia young fruits was the highest (0.06 μmol?min-1?g-1FW), and then decreased with the growth of fruits. The changes in the activities of ascorbate peroxidase (APX) were similar to the changes in the activities of GR. The changes in the activities of L-galactose-1,4-lactone dehydrogenase (GalLDH), a key enzyme of L-galactose pathway, were consistent with the changes in AsA contents. The GalLDH activity of Adelinia young and mature fruits showed higher than that of Heifeng and Brodtrop young and mature fruits, respectively. According to the correlation analysis, the GalLDH activity showed a highly significant positive correlationship with T-AsA, AsA, DHA, DHAR and MDHAR. The correlation coefficient was above 0.91. The higher GalLDH activity was found in the fruits, the higher AsA contents of fruits also was found. There was a highly significant positive correlationship between DHAR and MDHAR, T-AsA and AsA. The APX had a high correlation with T-GSH and GSH. 【Conclusion】 The AsA content of black currant young fruits was the highest and there were significant differences among the three cultivars. The GalLDH, MDHAR and DHAR might be the key enzymes for AsA anabolism in black currant fruits. The accumulation of AsA content of black currant fruits resulted from the activity of GalLDH, which indicated that the anabolic pathway played a more important role and were found to be a dominant position. The related enzymes of AsA-GSH recycling regeneration pathway also contributed to the AsA anabolism. The accumulation of high AsA content in black currant fruits resulted from the combined effects of anabolic and recycling pathways.

L.; fruit; ascorbic acid; anabolism; L-galactose-1, 4-lactone dehydrogenase

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.010

2018-05-29；

2018-09-19

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31201584）、黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C2017015）、黑龍江省博士后啟動(dòng)基金（LBH-Q17029）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“青年才俊”（16QC07）

孫小娟，E-mail：1837770189@qq.com。通信作者霍俊偉，E-mail：junweihuo@aliyun.com。通信作者秦棟，E-mail：dongq9876@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）