牛LncRNA-133a對骨骼肌衛星細胞增殖分化的影響

李燕，陳明明，張俊星，張林林，李新，郭宏，丁向彬，劉新峰

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牛LncRNA-133a對骨骼肌衛星細胞增殖分化的影響

李燕，陳明明，張俊星，張林林，李新，郭宏，丁向彬，劉新峰

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

【目的】探討長鏈非編碼RNA LncRNA-133a對牛骨骼肌衛星細胞增殖分化過程的影響?！痉椒ā坷脺y序樣品3、6、9月齡胎牛及24月齡成年和牛骨骼肌肌肉組織，qRT-PCR法檢測LncRNA-133a的組織時序表達譜。構建牛骨骼肌衛星細胞的體外成肌誘導分化模型，模擬牛骨骼肌的生長發育過程，qRT-PCR法檢測LncRNA-133a和肌細胞分化標記因子MyoG、MHC的細胞時序表達譜。利用過表達LncRNA-133載體（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 轉染牛骨骼肌衛星細胞，qRT-PCR法檢測轉染效率以及各轉染處理組LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表達水平，Western blotting檢測MHC 基因的蛋白表達水平；同時，通過EdU細胞增殖檢測、免疫熒光蛋白染色技術檢測牛骨骼肌衛星細胞增殖階段的細胞增殖量和分化階段的肌管融合程度?！窘Y果】組織表達譜分析發現LncRNA-133a在3月齡胎牛肌肉組織中表達量最高，6月齡胎牛肌肉組織中次之，9月齡胎牛及成年牛肌肉組織中表達量最低，時序表達呈下降趨勢；利用成功構建的牛骨骼肌衛星細胞體外誘導分化模型，進行LncRNA-133a、MyoG、MHC的細胞時序表達譜分析，結果發現在牛骨骼肌衛星細胞分化過程中（D0-D3），肌分化標記因子MyoG、MHC的表達水平逐漸升高，LncRNA-133a的表達在分化階段呈上升趨勢，且分化48 h時（D2）表達量最高；成功構建的過表達LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌衛星細胞模型，在增殖期（D0）：與對照組相比，過表達LncRNA-133a處理組EdU增殖染色檢測得到EdU陽性細胞數顯著增加（＜0.01），而LncRNA-133a抑制處理組EdU陽性細胞數顯著減少（＜0.01）；在分化48 h時（D2）：與對照組相比，LncRNA-133a過表達處理組肌細胞分化標記因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），Western blotting檢測MHC蛋白表達量顯著增加（＜0.01），且MHC蛋白的免疫熒光蛋白染色檢測觀察到融合肌管的體積占比更大；而LncRNA-133a抑制處理組MyoD、MyoG及MHC的mRNA表達水平均降低，其中MyoG顯著降低（＜0.05）, MHC蛋白表達量顯著減少（＜0.01），同時MHC蛋白融合肌管的體積占比也降低?！窘Y論】研究證實LncRNA-133a具有促進牛骨骼肌衛星細胞增殖及分化的作用，為進一步挖掘LncRNA-133a調節牛骨骼肌衛星細胞增殖分化調控網絡機制奠定了基礎。

LncRNA-133a；牛;骨骼肌衛星細胞；增殖；分化

0 引言

【研究意義】骨骼肌作為動物軀體最重要的組織之一，占重比可高達40%[1]，因此骨骼肌的發育對經濟動物肉牛來說意義重大。肌細胞作為骨骼肌的基本形成單位，它的分化發育直接影響到骨骼肌的發育形成[2]。隨著人們對LncRNAs研究的不斷深入，研究者已經發現許多LncRNAs可以參與肌細胞的增殖和分化過程[3-5]?！厩叭搜芯窟M展】linc-MD1及lnc-mg作為內源性競爭性RNA（ceRNA）促進肌細胞的分化發育[6-7]；lncRNA MAR1發揮其“sponge”吸附作用促進肌分化和再生[8]；Linc-YY1則通過與靶基因的互作作用促進肌分化和再生[9]；此外，還有Lnc-SEMT，H19等，也都在肌形成過程中發揮其重要的生物學功能[10-12]]。【本研究切入點】有關LncRNAs參與肌肉發育的研究已有很多，但多集中于模式動物小鼠的研究上。近年來，隨著生物檢測技術及生物信息學分析技術的發展，通過對牛骨骼肌肌肉組織進行高通量測序分析，已經獲得了大量與肌肉發育潛在相關的LncRNAs[13-15]。研究者針對這些 LncRNAs開展了一系列的功能研究，并證實了其中一些LncRNA如lncMD[14]、LncRNA-AK143003[15]、LncRNA HZ-5[16]、LncRNA H19[17]等，確實參與調節牛骨骼肌細胞的分化發育。但相較小鼠C2C12成肌細胞生長發育相關LncRNA的報道，參與調節牛骨骼肌細胞生長發育的LncRNAs的相關報道仍然較少，測序獲得的與牛肌肉發育相關的海量LncRNAs，還需要研究者不斷挖掘和證實它們的功能。【擬解決的關鍵問題】本研究利用前期在牛肌肉組織中鑒定到的長鏈非編碼RNA LncRNA-133a，通過表達譜分析，并進一步以體外分化牛骨骼肌衛星細胞為模型，通過過表達/抑制LncRNA-133a處理，探究其對牛骨骼肌衛星細胞增殖和分化過程的影響，旨在為牛骨骼肌生長發育相關LncRNAs的功能研究積累更多的有益資料。

1 材料與方法

試驗于2017—2018年在天津市農業動物繁育及健康養殖重點實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 肌肉組織與細胞來源 肌肉組織為天津市農業動物繁育及健康養殖重點實驗室凍存的3、6、9月齡胎牛及24月齡成年和牛骨骼肌肌肉；細胞為該實驗室分離凍存的原代牛骨骼肌衛星細胞。

1.1.2 主要儀器與試劑 CO2恒溫培養箱（日本三洋）；LightCycle 96實時熒光定量PCR儀（Roche）；Nano-Drop ND 2000c Spectrophotometer（Thermo- scientific）；熒光顯微鏡（Leica）。

pCDNA3.1-EGFP（武漢淼靈生物科技有限公司）；siRNA oligos（上海吉瑪基因）；Lipofectamine? 3000（Invitrogen）；Trizol reagent（Invitrogen）；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）；All-in- OneTMqPCR Mix（GeneCopoeia）；Hoechst 33342染色液（碧云天）；一抗，Anti-Myosin VⅡα antibody ab3481（abcom）；二抗，CY3-羊抗兔IgG（BA1032，博士德生物）；Cell-Light EdU Apollo 567 In Vitro Imaging Kit（RN:R11053.2，廣州市銳博生物科技有限公司）；qRT-PCR檢測相關引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛肌肉組織中LncRNA-133a時序表達譜鑒定 qRT-PCR檢測：3、6、9月齡胎牛及成年牛肌肉組織全基因組檢測LncRNA-133a的表達情況，其中3月齡胎牛肌肉組織作為對照。

1.2.2 細胞培養 常規復蘇實驗室前期凍存的原代牛骨骼肌衛星細胞[18]，利用原代牛骨骼肌衛星細胞體外培養模擬牛肌肉的發育進程[19]，使用增殖培養基：含體積分數20%的胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素和鏈霉素的DMEM，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。待增殖細胞融合度達80%—90%時將培養基更換為含體積分數2%馬血清的DMEM的分化培養基。

1.2.3 牛骨骼肌衛星細胞轉染及收集 24孔培養板內增殖期細胞融合度達50%時，按生產商家說明書利用Lipfectamine3000轉染已構建的過表達載體pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a（簡寫為pcDE-LNC）及抑制物 si-lncRNA133a，以空質粒pCDNA3.1-EGFP（簡寫為pcDE-NC）及si-NC轉染細胞作為對照，轉染后24 h時培養基更換為分化培養基。

細胞總RNA及總蛋白收集。增殖期細胞（D0）：更換分化培養基前收集；分化期細胞（D1—D3）：于更換培養基后24 h（D1）、48 h（D2）、72 h（D3）時收集。按生產商家說明書利用Trizol及蛋白裂解液裂解并提取細胞總RNA及蛋白。

1.2.4 LncRNA-133a、分化標記基因表達水平的檢測 qRT-PCR檢測：收集24孔板中增殖期（D0）、分化期（D1—D3）未處理細胞、各轉染處理細胞以及相應對照組細胞。取4 μg總RNA利用 All-in- OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉錄為第一鏈cDNA，再采用qRT-PCR法檢測各基因的表達。

qRT-PCR反應體系：10 μmol·L-1上游引物、10 μmol·L-1下游引物、2.0 μL 5x稀釋 cDNA、10 μL 2×All-in-OneTMqPCR Mix，Nuclease-free water 將體系補至20 μL。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 15 s，重復35個循環。qRT-PCR反應引物信息如表1所示。

1.2.5牛骨骼肌衛星細胞增殖、分化能力的檢測 qRT-PCR檢測：24孔板中細胞在轉染后DM2期時，檢測肌細胞分化標記因子MYOD（muscle regulatory factors, MRFs成員）、MYOG（myogenin）及MHC（Myosin heavy chain）的轉錄組表達情況。

EdU細胞增殖檢測：96孔板中細胞在轉染后D0期時，按Cell-Light EdU Apollo 567 In Vitro Imaging Kit試劑盒說明書檢測各處理細胞的增殖期細胞數。

MHC細胞免疫熒光檢測：48孔板中各處理細胞在DM2期時，進行肌衛星細胞分化標記因子MHC的免疫熒光蛋白染色檢測。

1.2.6 牛骨骼肌衛星細胞分化標記基因蛋白表達水平的檢測 Western blotting檢測：6孔板中細胞在DM2期時被蛋白裂解液裂解，收集蛋白，通過Western blotting檢測分化標志基因MHC的蛋白表達。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結果

2.1 LncRNA-133a的組織表達譜

LncRNA-133a是天津農學院動物分子育種與轉基因創新中心實驗室前期從3、6、9月齡胎牛肌肉組織的高通量測序數據中篩選鑒定出的組織時序表達呈下降趨勢的一條LncRNA。本研究利用qRT-PCR法，驗證不同月齡肌肉中LncRNA-133a的時序表達情況。如圖1：除在6月齡肋間肌及背腰肌中有相對上調外，LncRNA-133a在3、6、9月齡胎牛及成年牛各肌肉組織中均呈下降的表達趨勢。表明測序結果可靠，該LncRNA可進行下一步的功能研究。

圖1 3、6、9月齡胎牛及成年牛不同肌肉組織中LncRNA-133a的表達

2.2 牛骨骼肌衛星細胞LncRNA-133a及肌分化標記因子的表達水平

光鏡下觀察D0-D3時期牛骨骼肌衛星細胞的分化狀態并于對應時期收集細胞總RNA，qRT-PCR法檢測LncRNA-133a及肌分化標記因子的正常表達水平。如圖2、圖3：隨著骨骼肌衛星細胞進入誘導分化階段，牛骨骼肌衛星細胞分化形成的肌管清晰可見（圖2），且肌分化標記因子MHC及MyoG均呈上升表達趨勢，表明牛骨骼肌衛星細胞的體外誘導分化模型構建成功；LncRNA-133a在牛骨骼肌衛星細胞分化期間高表達，且分化48 h表達量最高，這提示其可能參與牛骨骼肌衛星細胞分化發育的調節過程。

圖2 牛骨骼肌衛星細胞分化進程（100×）

圖3 牛骨骼肌衛星細胞分化階段 LncRNA-133a及分化標記因子的表達

2.3 LncRNA-133a的過表達/抑制效率

牛骨骼肌衛星細胞轉染過表達LncRNA-133a載體pcDE-LncRNA-133A或LncRNA-133a的抑制物si-lncRNA133a 及相應對照載體pcDE-NC或對照抑制物si-NC。利用qRT- PCR法檢測轉染處理后D0及D2期過表達/抑制效率。相比pcDE-NC組，pcDE- LNC組LncRNA-133a在D0和D2期均有顯著過表達效果（圖4-A）；si-lncRNA133a 組相比si-NC組，si-lncRNA133a組LncRNA-133a在D0和D2期均有顯著抑制效果（圖4-B）。結果表明構建過表達/抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌衛星細胞模型成功，可進行下一步試驗驗證。

2.4 LncRNA-133a對牛骨骼肌衛星細胞增殖能力的影響

過表達/抑制LncRNA-133a 后D0期對牛骨骼肌衛星細胞進行EdU染色檢測牛骨骼肌衛星細胞增殖數。結果顯示：過表達LncRNA-133a組EdU陽性細胞數顯著增多；而抑制LncRNA-133a后，EdU陽性細胞數則顯著減少。這表明LncRNA-133a可以促進牛骨骼肌衛星細胞的增殖，對牛骨骼肌衛星細胞的增殖有著正向調控作用（圖5）。

圖4 qRT-PCR檢測LncRNA-133a的過表達（A）和抑制（B）效率

圖5 EdU檢測過表達/抑制LncRNA-133a后牛骨骼肌衛星細胞的增殖細胞

2.5 LncRNA-133a對牛骨骼肌衛星細胞分化能力的影響

qRT-PCR及Western blotting檢測過表達/抑制LncRNA-133a后D2期牛骨骼肌衛星細胞分化標記因子MHC、MyoD及MyoG 的mRNA水平及蛋白水平表達。過表達LncRNA-133a后，MHC、MyoD及MyoG的mRNA水平表達均呈顯著上調趨勢（圖6-A）；同時MHC在蛋白水平均也顯著上調（圖6-B）。而抑制LncRNA-133a后，MHC、MyoD及MyoG的mRNA水平表達均呈下調趨勢（圖7-A）；MHC在mRNA水平雖然下調不顯著，但蛋白水平下調顯著（圖7-B）。此外，通過免疫熒光染色試驗檢測MHC融合細胞也得到一致結果，如圖8：過表達LncRNA-133a后，MHC融合肌管數增多（圖8-A）；而抑制LncRNA-133a表達后，MHC融合肌管數減少（圖8-B）。

圖6 過表達LncRNA-133a促進牛骨骼肌衛星細胞分化

圖7 抑制LncRNA-133a表達阻滯牛骨骼肌衛星細胞分化

3 討論

肌肉發育分化是發育生物學研究的重要主題。肌細胞作為骨骼肌的基本形成單位，它的分化發育直接影響到骨骼肌的發育形成。肌細胞的分化和生長發育過程是內在遺傳、表觀遺傳和外在各種信號互作的結果，受到機體肌肉發育調節因子和調控通路的多層次精細調節。lncRNA作為一類調控因子參與肌肉的發育已是不爭的事實，相關報道也不斷涌現。

有研究表明通過EdU、CCK8或流式細胞儀檢測技術，甚至是細胞劃痕試驗得到如Sirt1[20]、lncRNA AK017368[21]、長非編碼RNA-GTL2[22]等LncRNAs具有促進肌細胞增殖的作用。本研究中，在過表達/抑制LncRNA-133a處理后24h（D0），通過EdU細胞增殖檢測初步驗證LncRNA-133a具有促進牛骨骼肌衛星細胞增殖的作用。

圖8 免疫熒光檢測過表達（A）/抑制（B）LncRNA-133a牛骨骼肌衛星細胞的分化標記因子MHC

在肌細胞分化過程中，骨骼肌特異性標記基因如MyoD 、MyoG 及MHC 開始表達[23]。其中，MyoD誘導細胞周期的退出同時開啟細胞分化[24-25]，骨骼肌分化決定因子MyoG受MyoD的啟動開始表達，并調控成肌細胞融合和肌纖維形成[26- 27]，而作為骨骼肌纖維內粗肌絲主要成分的MHC[28]，在肌細胞分化后期表達量逐漸升高。在各肌分化相關的研究中，通常把MyoD、MyoG、MHC作為肌分化標記因子[29-30]，利用qRT-PCR、Western blotting及免疫熒光蛋白染色分析等方法，檢測它們mRNA水平、蛋白水平及基因蛋白融合表達的變化來驗證肌細胞的分化進程。

通過這樣的驗證手法，現已證實如Linc-YY1、LncRNA Dum、LncMyoD、linc-MD1[9, 31-33]等LncRNAs參與調節肌細胞分化，且這類LncRNAs在成肌細胞分化階段呈時序性上升表達，所以后續的功能研究基本都集中在這些LncRNAs的高表達時期。此外，Albrecht等[34]研究發現，在3月齡牛胎兒的初級纖維中便可檢測到作為肌纖維成熟標記物的肌球蛋白，說明肌纖維的發育主要在妊娠早期。本研究中，通過對LncRNA-133a的時序表達譜分析發現：組織上，LncRNA-133a主要在3月齡胎牛肌肉組織中高表達；細胞上，LncRNA-133a在牛骨骼肌衛星細胞分化早期（D2）表達量最高。據此我們推測LncRNA-133可能參與調節牛骨骼肌衛星細胞的早期分化發育。在牛骨骼肌衛星細胞分化早期（D2）進行LncRNA-133a的功能驗證發現，有效過表達LncRNA-133a后，肌分化標記因子如MHC、MyoG、MyoD的mRNA水平均顯著上升，同時MHC在蛋白水平也顯著上調。同樣，在有效抑制LncRNA-133a后，對MyoG mRNA表達水平和MHC蛋白表達水平的下調影響是顯著的，對MHC、MyoD mRNA表達水平有不顯著的下調影響，這有可能是該檢測時期這些分化標記因子自身表達特性的影響。此外，MHC融合細胞的免疫熒光試驗分析也得到了一致結果。這些結果均表明LncRNA-133a可以促進牛骨骼肌衛星細胞分化。

現階段研究對LncRNAs在肌細胞增殖分化過程中扮演的經典調節角色已很明確：在肌細胞的增殖分化過程中，肌生長發育相關LncRNAs對成肌細胞的增殖與分化兩個生物學過程的促進或抑制調節作用是相反的，或只參與兩者其中一個，但這并不排除LncRNAs 對肌細胞增殖及分化有一致的促進或抑制作用，進而促進或抑制成肌纖維的形成，影響肌肉的生長發育。YUE[35]等研究發現，過表達lncYYW后通過mRNA microarray分析得到，GH1及其下游基因AKT1和PIK3CD上調，上調的GH1激活JAK促進成肌細胞增殖，同時也發現過表達lncYYW促進了成肌細胞的分化。相對于LncRNAs在其他生物學過程中（如腫瘤）調節作用機制的研究，LncRNAs對肌細胞增殖分化的研究仍有短缺，如2017年研究發現與乳腺癌轉移相關的LncRNA H19，在腫瘤轉移的不同階段（EMT和MET），通過吸附不同的miRNA均發揮其促腫瘤轉移作用[36]。綜上，本研究中LncRNA-133a促進肌衛星細胞的增殖分化，可能是LncRNA-133a通過某種互作機制對肌細胞增殖分化相關靶標的調控所致。

4 結論

利用前期鑒定的牛肌肉發育相關的長鏈非編碼RNA LncRNA-133a為研究靶標，經組織表達譜分析發現，LncRNA-133a在3、6、9月齡胎牛及成年牛骨骼肌中時序表達呈下降趨勢；進一步利用牛骨骼肌衛星細胞體外分化模型，經過表達和抑制LncRNA-133a后發現，LncRNA-133a對牛骨骼肌衛星細胞的增殖及分化均有促進作用。

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Effects of Bovine LncRNA-133a on the Proliferation and Differentiation of Skeletal Muscle Satellite Cells

LI Yan, CHEN MingMing, ZHANG JunXing, ZHANG LinLin, LI Xin, GUO Hong, DING XiangBin, Liu XinFeng

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384)

【Objective】The objective of this paper was to investigate the effects of long non-coding RNA LncRNA-133a on the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells. 【Method】This study used qRT-PCR to detect the expression level of LncRNA-133a in the skeletal muscle tissues of 3, 6 and 9 months old fetal cattle and 24 months old adult bovine skeletal muscle, and obtained the tissue temporal expression profile of LncRNA-133a. The in vitro induced myoblast differentiation model of bovine skeletal muscle satellite cells was constructed to simulate the growth and development of bovine skeletal muscle. The qRT-PCR was used to detect the cells temporal expression profiles of LncRNA-133a and myocyte differentiation markers MyoG and MHC. The bovine skeletal muscle satellite cells were transfected with LncRNA-133a overexpression vector (pCDNA3.1-EGFP- LncRNA-133a) or LncRNA-133a inhibitor (si-LncRNA 133a), and the transfection efficiency and the mRNA expression levels of LncRNA-133a, MyoD, MyoG and MHC were detected by qRT-PCR in each transfection treatment group, then the protein expression level of MHC gene was detected by western blotting. In addition, the cell proliferation of the bovine skeletal muscle satellite cells and the extent of myotube fusion at the differentiation stage were detected by EdU cell proliferation assay and immunofluorescence protein staining, respectively. 【Result】Tissue expression profiling revealed that LncRNA-133a had the highest expression in the muscle tissue of 3 months old fetal bovine, followed by the 6-month-old fetal bovine muscle tissue, and the lowest expression in the 9-month-old fetus and adult bovine muscle tissue, which demonstrated that the time expression showed a downward trend. Cell-time expression profiles of LncRNA-133a, MyoG, and MHC were analyzed by a successfully constructed bovine skeletal muscle satellite cell differentiation model in vitro, and the results showed that the expression levels of myogenic differentiation markers MyoG and MHC gradually increased during the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells (D0-D3). The expression of LncRNA- 133a increased in the differentiation stage, and the expression level reached the highest at 48 h of differentiation (D2). The bovine skeletal muscle satellite cell model of overexpressing LncRNA-133a or inhibiting LncRNA-133a was constructed successfully, and in the proliferative phase (D0): the number of EdU positive cells in the overexpressed LncRNA-133a-treated group was significantly increased (＜0.01), and the number of EdU positive cells in the LncRNA-133a inhibition treatment group was significantly decreased (＜0.01), compared with the control group. At 48 h of differentiation (D2): compared with the control group, the results of LncRNA-133a overexpression treatment showed that mRNA expression levels of myocyte differentiation markers MyoD, MyoG and MHC were significantly increased (＜0.05). Western blotting showed that the expression of MHC protein was also significantly increased (＜0.01), and the immunofluorescence protein staining of MHC protein showed that the volume of fusion myotubes was larger. On the contrary, in the LncRNA-133a inhibition treatment group, the mRNA expression levels of MyoD, MyoG and MHC were decreased, and MyoG was significantly decreased (＜0.05). Meanwhile, the expression of MHC protein was significantly decreased (＜0.01), and the volume fraction of MHC protein fusion myotubes was also decreased. 【Conclusion】Thus, this study confirmed that LncRNA-133a promoted the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells, which laid a foundation for further research on the regulatory network mechanism of LncRNA-133a regulating the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells.

LncRNA-133a; bovine; skeletal muscle satellite cells; proliferation; differentiation

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.013

2018-05-18；

2018-09-28

國家自然科學基金青年項目（31501938）、天津市“131人才工程第二層人選”項目（J01009030725）

李燕，E-mail：lihongjiliyan@163.com。通信作者丁向彬，E-mail：xiangbinding@aliyun.com。通信作者劉新峰，E-mail：lxf20001924036@126.com

（責任編輯 林鑒非）