代謝組學在類風濕關節炎中應用的研究進展

盧靖珊，楊 漸,2，許 盈,2，俞昌喜,2

(1. 福建醫科大學藥學院，2. 福建省天然藥物藥理學重點實驗室，福建 福州 350108)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性炎癥性疾病，主要表現為持續性的滑膜炎癥和關節軟骨損傷[1]。患病率較高，全球約為0.5%～1.0%，我國患病率約為0.3%～0.4%，主要患病年齡為40～60歲，女性高發，患病率約為男性的3倍[2]。該病導致關節軟骨的漸進性破壞，病情嚴重者可出現關節僵硬、關節畸形、關節強直，甚至關節脫位，致殘率極高，若未及時進行診斷治療，患者將喪失勞動能力，給社會造成巨大的經濟負擔。由于RA的病因不明，發病機制復雜，對RA的深入研究有助于進一步深入理解RA的病理生理學特點，以及進一步尋找其潛在的診斷或治療靶標。近年來，越來越多的學者將新興的代謝組學技術應用于RA的研究中，現就其研究進展進行綜述。

1 代謝組學研究技術的概述

代謝組學是從20世紀末開始迅速發展起來的，對某一生物或細胞中小分子內源性代謝產物進行定性和定量分析的一門新興學科。作為系統生物學的重要組成部分，代謝組學繼承了基因組學和蛋白質組學的“組學”研究思路，生物體內所有的代謝產物都需要分析，即從整體上研究機體受外界環境干擾后，其內源性代謝產物種類及數量的變化規律，全面地體現生物體對相應刺激的響應機制，具有即時、靈敏、全面等特點。其分析手段主要是應用現代分析技術(如核磁共振、氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用、毛細管電泳-質譜聯用等)，定性、定量地檢測生物樣本中的小分子內源性代謝物，通過結合化學信息學等技術，考察生物體在生理及病理狀態下或藥物干預前后，其內源性代謝產物的變化，尋找到疾病潛在的具有特異性的生物標記物，從而闡明藥物的作用機制、揭示疾病的發病機制，為疾病的診斷與治療提供參考[3]。

2 代謝組學在RA相關研究中的應用

2.1 揭示RA的早期生物標志物RA早期生物標志物是從機體血液或其他體液、組織液中發現的某種成分，作為RA的一種發生信號，能用于健康人群的篩檢及RA患者的早期診斷和治療反應預測[4]。利用代謝組學的研究方法，尋找具有特征性的RA早期生物標志物，是代謝組學在RA研究中主要的目的。

目前，國內外針對RA早期生物標志物的代謝組學研究非常有限。C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種急性蛋白，當機體受到感染或組織損傷時，其含量會急劇上升，以清除入侵機體的物質，傳統觀點認為CRP是一種非特異性的炎癥標志物。Young等[5]采用基于核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術的代謝組學研究，發現早期RA患者血清中的CRP較健康人群明顯增多，通過結合早期RA的癥狀及含量異常的代謝物等因素，可對早期的RA進行分期。Surowiec等[6]采用LC-MS的代謝組學研究方法，分析30例RA早期患者和19例健康人群的代謝物譜。研究發現，在RA早期患者的血漿樣本中可以檢測到脂類物質的變化，神經鞘磷脂(sphingomyelin，SM)與溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidyl- choline，LPC)的含量在RA早期患者體內較對照個體內處于更高的水平，且隨著RA的發生與發展，SM與LPC的含量也逐漸上升，提示SM與LPC是疾病強有力的預示因子，可用于反映疾病的病程進展。另有學者指出，SM與LPC在早期骨關節炎(osteoarthritis，OA)患者體內的含量也異常升高，在鑒別診斷早期RA與早期OA上，未找到差異性物質[7]。Michopoulos等[8]采用液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的代謝組學研究方法，在Tg197轉基因關節炎小鼠模型上進行RA的相關研究。通過小鼠的后肢提取物代謝譜圖發現，對照組(野生型健康小鼠)和Tg197小鼠之間的代謝表型具有明顯的差異，甲叉琥珀酸(itaconic acid)僅在Tg197小鼠中檢測到，表明甲叉琥珀酸與RA的發生有直接聯系。當Tg197小鼠接受抗RA生物藥英夫利昔單抗治療時，其體內甲叉琥珀酸的濃度變化有所減緩甚至逆轉，從而發現RA潛在的早期生物標志物甲叉琥珀酸。隨后，為進一步確證甲叉琥珀酸為RA的早期生物標志物，并評估由動物模型得出的結論與人體的相關性，作者通過對18例RA患者的人成纖維細胞進行人腫瘤壞死因子(human tumor necrosis factor，hTNF)處理，發現經hTNF處理的人成纖維細胞內存在大量的甲叉琥珀酸，而其對照組中未檢測到。研究顯示，甲叉琥珀酸在所有受檢標本中均與疾病表型有很強的相關性，證實了甲叉琥珀酸在RA早期診斷的價值，為RA的早期診斷提供了理論依據。

2.2 發現RA標志物逆推完善通路機制眾所周知，基因組學和蛋白質組學分別是從基因與蛋白質的水平來研究生物體生命活動的學科。然而，機體內有許多生命活動與代謝物的含量密切相關。代謝物可反映生命過程中發生的一系列的生物化學反應，代謝物的變化正是機體體內變化過程的反映。利用代謝組學尋找到RA潛在的生物標志物，通過其代謝通路逆推找出其調節酶和調控基因，完善疾病的通路機制，對RA發病機制的深入理解具有重要的指導意義。

NLRP3炎性小體是固有免疫的重要組成成分，在機體的免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用，Guo等[9]報道了NLRP3與RA的發病機制相關。Pang等[10]在膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠中進行甲氨蝶呤對RA炎癥抑制作用的代謝組學研究，發現甲氨蝶呤主要是通過抑制核轉錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和NLRP3/caspase-1通路，下調通路相關的細胞因子水平，抑制促炎性脂質的釋放，促進抗炎性介質的產生，從而調節炎癥相關的代謝網絡，減輕CIA大鼠的炎性腫脹，抑制關節組織炎癥的發生。

Yang等[11]通過代謝組學研究發現，RA的發病機制可能與能量代謝異常有關，進一步通過定量檢測與能量代謝相關的蛋白質，發現在RA患者體內磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDHA)等厭氧分解代謝酶有所上調，而有氧氧化和脂肪酸氧化的酶有所下調(如檸檬酸合成酶、二氫硫辛酰胺轉琥珀酰酶、磷酸葡萄糖酸脫氫酶、長鏈脂酰CoA合成酶、長鏈烯脂酰輔酶A脫氫酶等)。缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)可參與機體的炎癥反應，改善機體的炎癥狀態，通過敲低HIF-1α的表達，發現成纖維樣滑膜細胞中的有氧氧化酶和脂肪酸氧化酶的表達減少，而厭氧分解代謝酶的表達有所增加。研究結果表明，滑膜液中葡萄糖和乳酸可用作診斷RA的可靠生物標志物，由HIF-1α通路調節的厭氧分解代謝增強和有氧代謝減少是促進RA進展的重要因素。該研究利用代謝組學技術，完善了從代謝物到上游調節酶與調控基因的通路機制。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是一種由激活的單核巨噬細胞產生的，能夠抑制成骨細胞及刺激破骨細胞的細胞因子，多項研究指出，TNF是治療RA的一個重要靶標[12]。Narasimhan等[13]應用基于1H-NMR的代謝組學研究方法，分析19例RA患者的血清代謝物譜，尋找與滑膜標記基因表達相關的血清代謝物，研究提示血清中的代謝物與滑膜組織中的細胞因子簇具有一定的相關性。血清中膽堿和葡萄糖水平與滑膜組織中TNF-α和CD3分化簇(cluster of differentiation3，CD3)基因的表達呈負相關，血清中琥珀酸酯通過抑制脯氨酸而促進炎癥細胞因子IL-1β的表達，與滑膜組織中的IL-1β基因的表達呈正相關。研究結果提示，除TNF-α外，滑膜組織中的CD3ε和IL-1β基因的表達也與RA的發病密切相關。研究表明，代謝物不僅可以作為炎癥滑膜組織引起的紊亂的生物標志物，還可以用于預測滑膜組織中與RA相關的基因表達，進而完善RA發病的通路機制，充分說明了代謝組學技術在RA發病機制研究中的獨特優勢和潛力。

2.3 闡明RA疾病的發病機制RA的發病與多種因素相關，其發病機制目前尚未明確，要探究復雜的RA發病機制需要對機體的代謝物組有全面的了解。利用代謝組學技術全面、即時、靈敏的研究特點與優勢，從代謝角度闡明RA的發病機制，更系統全面地揭示RA的發病機制。

2.3.1RA發病與能量代謝異常相關 乳酸、丙酮酸、檸檬酸等是與能量代謝過程有關的產物，Zheng等[14]采用佐劑關節炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)大鼠模型模擬人體急性關節炎的發病過程，發現AIA大鼠體內的丙酮酸、乳酸水平相對升高，而檸檬酸的含量相對減少。在氧供應相對不足時，機體通過葡萄糖不完全分解生成乳酸提供能量，乳酸水平的升高說明了AIA大鼠體內的糖無氧酵解異常加強。檸檬酸是三羧酸循環的重要中間代謝產物，檸檬酸含量的相對減少提示AIA大鼠體內的糖有氧代謝部分受到抑制。Shan等[15]在CIA大鼠上同樣觀察到能量代謝紊亂的現象。此外，Yang等[11]通過分析比較25名RA患者和10名健康受試者的滑膜液樣品，發現RA患者滑膜液中葡萄糖、檸檬酸的濃度相對減少，而乳酸濃度明顯升高，提示RA代謝物質差異的產生機制與無氧酵解和有氧代謝的失衡相關。由此可見，RA的發病機制可能與能量代謝異常有關。

2.3.2RA發病與脂質代謝異常相關 據報道，RA患者的心血管病死率是普通人的2倍，尤其是冠狀動脈粥樣硬化的患病風險增加，提示RA發病可能與脂質代謝異常有關。歐陽昕等[16]應用基于NMR譜的代謝組學研究方法，對30例RA患者及35名健康人進行了評估，脂質譜分析顯示，RA患者體內存在一定程度的脂質代謝紊亂，其血清中高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、膽固醇和磷酸膽堿(phosphatidyl choline，PC)的含量相對減少，而低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的含量相對增高。研究結果表明，膽固醇、乳酸、乙酰化糖蛋白和脂質是RA的候選生物標志物。HDL可將蓄積于末梢組織中的游離膽固醇與血液中的脂蛋白運送到肝臟組織，以維持細胞內膽固醇含量的相對恒定，HDL含量的減少，使膽固醇在體內累積，促進機體的炎癥反應。體內的LDL主要由VLDL轉變而來，其主要功能是運載膽固醇進入全身各組織細胞，當機體內的LDL過量時，它所運載的膽固醇便會積存于血管壁上，對血管內膜造成炎癥樣刺激，從而加速了RA的發生和發展。此外，Giera等[17]通過脂質組學，定量分析RA患者滑膜液中溶血卵磷脂與卵磷脂類的含量波動，佐證了RA的發病與體內脂質代謝的異常相關。花生四烯酸(arachidonicacid，AA)是人體的一種必需脂肪酸，是多種生物活性物質的前體，具有重要的生物學作用，Wang等[18]在AIA大鼠上觀察AA代謝的變化，發現AIA大鼠在環氧合酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)催化的AA代謝途徑中，有19種代謝產物較正常組明顯增加，治療后則恢復到正常水平。Ding等[19]采用CIA大鼠進行血清代謝組學的研究，同樣發現了AA代謝紊亂的現象，提示RA的發病機制可能與AA和磷脂代謝網絡的失調有關。另外，Pang等[10]通過血漿代謝組學的研究方法，對CIA大鼠的代謝變化進行全面的評價，亦發現RA的發病與AA、亞油酸和鞘脂代謝異常相關。

2.3.3RA發病與氨基酸代謝紊亂相關 甘氨酸(glycine，Gly)是許多代謝反應中的關鍵化合物，甘氨酸受體(glycine receptor，GlyR)是一種重要的抑制性受體，分布在各細胞膜上(如單核巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等)，并參與體內的免疫反應和炎癥反應。Gly可通過與其受體結合，抑制這些細胞的活性，從而發揮抗炎作用。牛磺酸在抗氧化、維持膜穩定和調節滲透壓等生物過程中起著重要的作用，可直接清除氧自由基，進而抑制氧化應激誘導的炎癥反應。Yun等[20]發現，CIA大鼠血清Gly水平明顯下降，而牛磺酸水平明顯升高，紊亂的氨基酸代謝水平提示CIA大鼠體內存在炎癥反應。Li等[21]采用LC-MS的代謝組學研究方法，測定30例RA患者和32例健康對照者的內源性代謝產物，發現RA患者血清中的谷氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-脯氨酸明顯升高，而色氨酸、精氨酸的含量則明顯下降。有研究報道，谷氨酸可能是RA的一種新的預測因子，與早期骨侵蝕有關[22]。色氨酸可以反映膝關節骨關節炎的存在和嚴重程度，與炎癥反應密切相關[23]，色氨酸代謝的增加，提示了其機體內存在炎癥反應。這些發現提示，RA患者體內的氨基酸分解代謝異常增強，紊亂的氨基酸分解代謝與炎癥關節的低氧狀態，限制了葡萄糖和其他大分子從血液擴散進入滑膜，導致脂質降解增加，酮體在滑膜內富集，最終致使RA的發生。

2.3.4RA發病與機體氧化應激相關 氧化應激是指機體內氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化能力相對不足，機體的自由基異常增多，導致中性粒細胞炎性浸潤，從而引起細胞和組織的損傷。Kim等[24]通過對RA和其他類型關節炎(強直性脊柱炎、貝特病和痛風)患者的滑膜液樣品進行代謝分析，發現RA患者滑膜組織內的谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶含量相對減少，機體的抗氧化能力減弱，且自由基大量堆積，過量的自由基破壞了軟骨細胞，使滑膜與骨質受損，最后導致RA的發生。He等[25]采用代謝組學結合超微弱光子發射(ultra weak photon emission，UPE)技術，研究CIA小鼠的炎癥反應與氧化應激的關系。這些研究顯示，RA的炎癥反應和活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導的血漿代謝產物的升高、胺代謝產物的系統性減少密切相關。ROS是機體在有氧代謝過程中的產物，過高的ROS水平會對細胞的結構造成損壞[26]，高濃度的ROS可通過未配對的自由基氧化各細胞及細胞外的部分，破壞細胞膜中多不飽和脂肪酸分子的丙烯雙鍵，使細胞膜的流動性與通透性發生變化，最終使細胞整體結構破壞和功能紊亂，加劇機體的炎癥反應，促使RA的發生。

3 結論與展望

綜上所述，代謝組學技術憑借其高靈敏度、高準確度及全面性的研究特點和優勢，在RA的早期診斷方面具有更好的可靠性和預見性，使快速的臨床干預成為可能，為RA的預防、早期診斷和治療提供新的思路。從代謝角度揭示RA的發病機制，對輔助臨床RA的診斷及治療具有重大的指導意義。未來隨著檢測技術和生物信息技術的不斷改進與發展，代謝組學的研究方法不僅有望成為臨床診斷RA的新工具，而且有助于理解該病發生的病理機制、觀察其病情的發展與預后，具有廣闊的應用前景。