雙亞芐基哌啶RA190阻滯HL60細胞于G0/G1期并誘導細胞凋亡

鄭曉輝，徐淑娟，黃家福，林振興， 祝珊珊，許雅蘋，馬麗娟，黃黎月

(1. 廈門醫(yī)學院機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室,福建 廈門 361023；2. 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液科,福建福州 350001；3. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科，廣東 廣州 511436; 4. 廈門醫(yī)學院科學實驗中心,福建 廈門 361023)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是具有明顯遺傳異質(zhì)性的臨床侵襲性疾病。靶向異常基因治療是當前研究熱點。黏附調(diào)節(jié)分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶體亞單位19S調(diào)節(jié)顆粒上兩個主要泛素受體之一，決定26S蛋白酶體結構不對稱性。該蛋白在多細胞真核生物內(nèi)高度保守，在生命過程中可能發(fā)揮重要功能。有研究表明[1-3]，ADRM1在肝癌、胃癌、急性白血病等多種惡性腫瘤中過表達，下調(diào)ADRM1蛋白水平可明顯抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡。因此，ADRM1可能成為腫瘤治療靶點。

雙亞芐基哌啶RA190是近幾年研究發(fā)現(xiàn)的ADRM1抑制劑，通過與ADRM1的半胱氨酸88共價結合，抑制蛋白酶功能[4]。本實驗擬通過檢測不同濃度RA190作用下HL60細胞活率，分析細胞周期與凋亡及ADRM1蛋白水平，以了解RA190在AML中作用機制，為AML治療采用靶向ADRM1策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人急性粒細胞白血病部分分化型細胞HL60為本實驗室保存。RA190(MCE)；PI(KeyGEN Biotech)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot抗體(CST公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Corning)；胎牛血清(Gemini)。流式細胞儀EPICSXL(BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1細胞毒性實驗 設不同濃度RA190(終濃度0.5、1、2、4 μmol·L-1)實驗組和空白對照組，采用臺盼藍拒染法于細胞自動計數(shù)板上計數(shù)。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期與凋亡 設不同濃度RA190實驗組(0.5、1 μmol·L-1)和空白對照組，按照PI及Annexin V FLUOS Staining Kit試劑盒說明書操作。

1.2.3Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達 收集各組細胞，PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進行Western blot實驗。10% SDS-PAGE電泳后，轉膜，分別用β-actin、ADRM1、Cyclin B1一抗與膜上的抗原結合，然后用HRP偶聯(lián)的二抗與其反應，用ECL化學發(fā)光試劑檢測，經(jīng)壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達情況。

2 結果

2.1 RA190對HL60細胞增殖的影響隨RA190濃度提高，HL60細胞活率降低(Tab 1)，說明RA190抑制HL60細胞增殖，半抑制濃度(IC50)約為3.1 μmol·L-1。

Tab 1 Viability of HL60 cells treated with differentconcentrations of RA190 for 24

2.2 RA190阻滯HL60細胞于G0/G1期RA190作用下，HL60細胞G0/G1期比率比空白對照組明顯增加(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Cell cycle and apoptosis of HL60 treated with different concentrations of

*P<0.05vsRA190 0 μmol·L-1

2.3 RA190促進HL60細胞凋亡Tab 2結果顯示，隨著RA190濃度提高，HL60細胞早期與晚期凋亡均增加(P<0.05)。

2.4 RA190對ADRM1蛋白水平影響由于RA190誘導HL60細胞G0/G1期阻滯，本實驗檢測了Cyclin B1蛋白水平。結果顯示，實驗組細胞ADRM1與Cyclin B1蛋白表達均減少。

3 討論

研究表明[4-5]，雙亞芐基哌啶RA190與泛素受體ADRM1結合后，快速觸發(fā)多泛素蛋白累積，誘導對硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌等多種腫瘤細胞增殖。本實驗中，隨RA190濃度提高，HL60細胞活率下降、凋亡增加、G1期停滯，說明RA190對HL60細胞具有明顯毒性；此時細胞內(nèi)ADRM1和Cyclin B1蛋白減少。這與預期及其他學者研究結果一致。

ADRM1募集UCH37形成ADRM1/UCH37復合物，介導NF-κB降解與活性，參與細胞周期和凋亡過程。UCH37通過影響B(tài)ax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制細胞凋亡；NF-κB轉錄因子對絕大多數(shù)惡性腫瘤具有促癌作用。因此，ADRM1可能通過UCH37抑制HL60細胞凋亡，也可能通過NF-κB信號通路起作用。

腫瘤細胞增殖加速常伴隨細胞周期改變，而細胞周期受周期調(diào)控蛋白影響。哺乳動物細胞中，Cyclin B從G1期晚期開始表達并逐漸積累，到G2期后期達到最大值，并一直維持到M期中期后迅速降解。RA190作用下，細胞內(nèi)Cyclin B1蛋白表達減少，阻滯細胞從G1期進入S期，其機制是RA190的直接作用，還是ADRM1表達減少導致？有待后續(xù)研究。