真菌菌體直接PCR擴增的方法研究

林艷云，陳憶婷，黃曉明，林峻＊

（1.福州大學(xué) 至誠學(xué)院，福建福州 350001；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108）

真菌的種類繁多，既有對人類生產(chǎn)生活有益的真菌，同時也有對人類健康有害的病原真菌[1]。真菌與其他微生物共同作用，對生態(tài)環(huán)境具有重要的作用，能夠保持生態(tài)系統(tǒng)中有序的物質(zhì)循環(huán)和能量流動[2]。真菌可以作為生態(tài)系統(tǒng)的分解者[3]，具有生物防治病原體[4]、富集重金屬[5-6]、降解農(nóng)藥[7-8]等多種作用。現(xiàn)今人們進(jìn)一步加大對真菌資源的開發(fā)利用，例如利用黑曲霉代謝系統(tǒng)及產(chǎn)酶系統(tǒng)來生產(chǎn)檸檬酸[9]、木聚糖酶[10]、淀粉酶[11]等；米曲霉可作為發(fā)酵調(diào)味品的生產(chǎn)菌株[12]，普遍用于蛋白酶和淀粉水解酶的生產(chǎn)，同時它被美國食品與藥品管理局認(rèn)定為安全微生物菌種[13]；利用里氏木霉的代謝特點可將木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)原料[14]，生產(chǎn)可再生能源，不僅能實現(xiàn)對廢物的再利用，也能提供新型能源。對這些重要的生產(chǎn)用真菌的生產(chǎn)控制，科研人員不僅從代謝調(diào)控和發(fā)酵條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，也從基因工程的角度對其進(jìn)行改造，如構(gòu)建食品級木聚糖酶黑曲霉工程菌[15]。在對真菌進(jìn)行基因改造時，難以避免需要對真菌基因組進(jìn)行提取，而傳統(tǒng)的真菌基因組提取方法較為繁瑣，因此本文以黑曲霉513.88（Aspergillus niger 513.88），米曲霉 2397（Aspergillus oryzae 2397），尼崎青霉（Penicillium amagasakiense），里氏木霉（Trichoderma reesei）作為研究對象，研究并探討了一種能夠簡便快速提取真菌基因組，并且對其進(jìn)行直接PCR擴增的方法，這能夠為真菌基因組的快速提取與擴增提供另一種思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑曲霉513.88、米曲霉2397、尼崎青霉、里氏木霉，均由福州大學(xué)應(yīng)用基因組學(xué)研究所提供。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

臺式高速離心機（Eppendorf 5430），梯度PCR儀（Biosafer 9700），電熱恒溫水浴鍋（HWS12型），超微量核酸光度計（Nanodrop 2000），生化培養(yǎng)箱（BPC-70F），全自動凝膠成像分析儀（JS-680D）。

1.2.2 主要試劑

康為世紀(jì)2×Taq PCR mix，Takara 250 bp DNA Ladder Marker，λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker，液氮，生工生物工程（上海）有限公司真菌基因組DNA快速提取試劑盒，A公司產(chǎn)細(xì)胞裂解液，B公司產(chǎn)細(xì)胞裂解液，實驗室自制細(xì)胞裂解液。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將菌種接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)，直至單菌落形成。

1.3.2 液氮研磨法提取基因組

收集瓊脂平板上的真菌菌體，在研缽中用液氮快速研磨，形成粉末，然后使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取真菌DNA，對提取得到的產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

1.3.3 裂解液提取基因組

用無菌槍頭挑取菌落，分別加入到50 μL A公司細(xì)胞裂解液、B公司細(xì)胞裂解液、實驗室自制裂解液中，進(jìn)行裂解，其裂解條件為：A公司細(xì)胞裂解液（80 ℃，5 min），B公司細(xì)胞裂解液（80 ℃，15 min），實驗室自制裂解液（85 ℃，15 min）。

1.3.4 PCR引物

用于擴增在真菌中保守的18s rRNA基因的PCR引物設(shè)計如下：

18sF：5'-GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG-3'

18sR：5'-CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC-3'

1.3.5 PCR

將裂解后的產(chǎn)物進(jìn)行直接PCR，反應(yīng)體系為：3 μL裂解產(chǎn)物，上游引物1μL，下游引物1 μL，引物濃度為 10 μmol/L，2×Taq PCR mix 25 μL，無菌水20 μL，PCR擴增循環(huán)程序為：預(yù)變性94 ℃，10 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 53 ℃ 30 s，延伸 72 ℃90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳，以便進(jìn)一步驗證。

1.3.6 PCR結(jié)果測序及產(chǎn)物序列比對

將PCR產(chǎn)物送交安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行Sanger測序，并使用Blast生物信息學(xué)分析工具，對測序得到的DNA序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液氮研磨法提取基因組DNA結(jié)果分析

經(jīng)液氮研磨，真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取得到的產(chǎn)物，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、圖2所示。由圖可知，該試劑盒能夠成功提取到4種真菌的基因組DNA，但里氏木霉和米曲霉2397有拖帶現(xiàn)象，提示所提取的基因組DNA有部分降解。

圖1 黑曲霉513.88基因組DNA抽提結(jié)果

圖2 里氏木霉、尼崎青霉、米曲霉2397基因組DNA抽提結(jié)果

2.2 液氮研磨產(chǎn)物PCR擴增結(jié)果分析

液氮研磨產(chǎn)物經(jīng)試劑盒提取后進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果如圖3所示。4種真菌均有目的條帶，里氏木霉、尼崎青霉、黑曲霉513.88的擴增條帶明亮，試劑盒抽提效果好，但是米曲霉2397 PCR擴增條帶較暗，可見該試劑盒對米曲霉2397基因組提取效果不佳。

圖3 液氮研磨產(chǎn)物PCR擴增結(jié)果

2.3 黑曲霉513.88裂解產(chǎn)物直接PCR擴增結(jié)果分析

對黑曲霉513.88進(jìn)行裂解液處理并直接PCR后，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示。目的條帶為1 634 bp，1、2、3泳道在1 500～2 250 bp有清晰條帶，可見使用3種裂解液都能提取到黑曲霉513.88的基因組DNA并成功進(jìn)行后續(xù)的PCR擴增。

圖4 黑曲霉513.88基因組直接PCR擴增結(jié)果

2.4 黑曲霉513.88 PCR擴增產(chǎn)物測序分析

經(jīng)過Sanger法測序，測序得到單峰峰圖，對該測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對，與Aspergillus niger的基因組序列相似度為99%，PCR擴增產(chǎn)物可以確定為黑曲霉的基因組DNA。

2.5 米曲霉2397裂解產(chǎn)物直接PCR擴增結(jié)果分析

PCR電泳產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖5所示。電泳結(jié)果沒有目的條帶，可見此法并不適用于米曲霉的基因組提取與擴增。

圖5 米曲霉2397基因組直接PCR擴增結(jié)果

2.6 尼崎青霉裂解產(chǎn)物直接PCR擴增結(jié)果分析

尼崎青霉PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖6所示。電泳結(jié)果沒有條帶，可見此法并不適用于尼崎青霉的基因組提取與擴增。

圖6 尼崎青霉基因組直接PCR擴增結(jié)果

2.7 里氏木霉裂解產(chǎn)物直接PCR擴增結(jié)果分析

分別采用3種裂解液裂解里氏木霉，其基因組PCR擴增結(jié)果如圖7所示。第1、2、3泳道在1 500～2 250 bp有條帶。但使用實驗室自制裂解液提取的基因組擴增產(chǎn)物條帶明亮，A公司細(xì)胞裂解液裂解效果次之，B公司細(xì)胞裂解液基因組擴增產(chǎn)物電泳條帶最暗。

圖7 里氏木霉基因組直接PCR擴增結(jié)果

2.8 里氏木霉PCR擴增產(chǎn)物測序分析

里氏木霉PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sanger法測序，測序得到單峰峰圖，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行測序結(jié)果比對，該菌的基因組序列與Trichoderma reesei的基因組序列相似度為99%，PCR擴增產(chǎn)物可以確定為黑曲霉基因組DNA。

3 結(jié)論

PCR擴增能否成功，其重點在于提取的真菌基因組DNA質(zhì)量的高低。真菌的細(xì)胞壁富含多糖等特殊成分，抗逆性強，而要提取到高質(zhì)量的真菌基因組DNA，關(guān)鍵問題就在于破壁的成功。實驗室常用的破壁方法包括液氮研磨法、尿素裂解法、凍融法、打擊震蕩法、氯化芐法和酶消化法等。對于某些真菌，因其細(xì)胞壁較為“柔軟”，采用酶消化法就可以實現(xiàn)對真菌的破壁處理，并提取到基因組DNA。但是對于絕大多數(shù)的真菌，由于其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與成分的特殊性，具有較強的耐受性，為了達(dá)到良好的破壁效果，就需要應(yīng)用其他物理方法如超聲波、高壓等共同作用。本方法采用市售常見細(xì)胞裂解液對真菌細(xì)胞進(jìn)行直接裂解，結(jié)果顯示黑曲霉513.88和里氏木霉這兩種重要的真菌可以在細(xì)胞裂解液處理后實現(xiàn)直接PCR擴增，但是對米曲霉2397和尼崎青霉沒有效果。多糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分，對于不同類群的真菌，細(xì)胞壁中多糖的類型也會有所不同[16]，可能是由于米曲霉2397和尼崎青霉細(xì)胞壁多糖對裂解液成分不敏感，造成破壁困難。同時對于真菌細(xì)胞壁來講，細(xì)胞壁各成分所占比例與細(xì)胞生活周期有關(guān)，而細(xì)胞壁成分比例的高低又會影響到破壁的難易，當(dāng)細(xì)胞尚處于幼嫩階段，較容易破壁，反之較難破壁[17]，從而導(dǎo)致后續(xù)PCR擴增失敗。本研究結(jié)果表明，市售的常見細(xì)胞裂解液，可以對部分真菌物種實現(xiàn)直接裂解和PCR擴增，若善加利用，可以減少真菌破壁的繁瑣操作，從而簡化對真菌進(jìn)行基因工程改造的步驟，進(jìn)一步提高改造的效率。