血三七中巖白菜素的分離鑒定及抗氧化研究

陳翱天，李書華

（1.四川省樂山第一中學(xué)校，四川樂山 614000；2.樂山師范學(xué)院 化學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000）

血三七是蓼科植物中華抱莖蓼（Polygonum amplexicaule var. sinense）的干燥根莖[1]，具有清熱解毒、止痛散瘀和止血的功效，可用于治療骨折、外傷出血、跌打損傷等[2]，為苗族和土家族常用藥。現(xiàn)代藥理研究表明，血三七具有抗氧化[3]、抗菌[4]和治療動脈粥樣硬化[5]等多種藥理作用。目前，血三七的化學(xué)成分研究表明，血三七主要含有黃酮類、蒽醌類及酚酸類化合物[6]，這些化合物分別具有抗氧化[3]、抗病毒[7]、抗菌[8]和鎮(zhèn)痛[9]等多種作用。

為了進(jìn)一步研究血三七的化學(xué)成分，以血三七粉末為原料，采用95%乙醇室溫浸提，50 ℃減壓濃縮后得到無醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。將此除脂醇提液濾膜過濾后，通過制備液相分離，得一單一組分，將該單一組分濃縮后結(jié)晶，得到單體化合物。通過核磁共振技術(shù)鑒定該單體化合物為巖白菜素，并以維生素C作為陽性對照，采用清除DPPH自由基試驗(yàn)方法研究該化合物的抗氧化活性，探討了其抗氧化機(jī)理，展望巖白菜素作為抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血三七，購自安徽亳州中藥材市場。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），購自北京中生瑞泰科技有限公司。維生素C，購自上海源葉生物科技有限公司。RE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南鞏義瑞德儀器廠），Waters色譜儀，GeLai制備液相色譜，Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 巖白菜素的提取與制備

將2.00 kg干燥的血三七根粉碎，用6 L乙醇（95%）室溫浸泡提取72 h，過濾；濾渣再次用6 L乙醇（95%）室溫浸泡提取72 h，過濾，合并濾液。在減壓及50 ℃條件下濃縮濾液至無醇水液；然后用500 mL乙酸乙酯萃取兩次，除去脂溶性成分，得到血三七的除脂醇提液。將該除脂醇提液過濾處理，經(jīng)中壓制備液相色譜儀制備分離，按照各峰收集洗脫液，濃縮各洗脫液至干，甲醇溶解，放置結(jié)晶，待晶體析出，過濾，即得到純品化合物，并以分析液相檢測該化合物的純度。

1.2.2 巖白菜素的結(jié)構(gòu)鑒定

以氘代甲醇為溶劑，用Varian INOVA 400核磁共振譜儀進(jìn)行核磁測試，解析核磁共振氫譜和碳譜圖，得到化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.3 抗氧化性能的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，采用DPPH清除率法，以維生素C為陽性對照，研究純品化合物巖白菜素的抗氧化活性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

抗氧化性能的測定試驗(yàn)中，以維生素C作為陽性對照，以空白為分光光度計(jì)調(diào)零，做3組重復(fù)，抗氧化性能取3組實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖白菜素的制備

將用2.00 kg干燥的血三七獲得的除脂醇提液濃縮至80 mL，加入20 mL甲醇搖勻，配制成100 mL溶液，將該溶液先用普通濾紙過濾，濾液再用0.45 μm的濾膜過濾，得到樣品的制備液。將樣品的制備液一次性吸入制備液相色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間60 min；0 min時(shí)，乙腈含量為5%，60 min時(shí)，乙腈含量為60%；流速20 mL/min，檢測波長275 nm。按照峰收集洗脫液，濃縮各個(gè)峰的洗脫液，濃縮干后，用甲醇溶解，放置，結(jié)晶，過濾，得到小顆粒狀無色晶體，待晶體干燥后稱重3.2 g。以分析液相色譜儀檢測該化合物純度為98.5%（檢測條件：檢測波長275 nm，流速1 mL/min，洗脫液為乙腈-水，設(shè)定時(shí)間為20 min，0 min時(shí)，乙腈比例為5%，20 min時(shí)，乙腈比例為40%），如圖1所示。

圖1 巖白菜素的HPLC純度

2.2 巖白菜素的鑒定

通過核磁測試得到該化合物的核磁共振氫譜圖，如圖2所示。從核磁共振氫譜（1H-NMR，CD3OD）可以看出，δ 7.07（1H, s, H-7），δ 4.94（1H,d, J=12 Hz, H-10b），4.07 (1H, d, J=8 Hz, H-4a)，4.03(1H, d, J=8 Hz, H-11)，3.90（3H, s, -OCH3），3.82 (1H,t, J=8 Hz, H-4)，3.70（1H, m, H-11），3.66（1H, m,H-2），3.44（1H, t, J=8 Hz, H-3)。通過核磁測試得到該化合物的核磁共振碳譜圖，如圖3所示。由核磁共振碳譜（13C-NMR，CD3OD）可以看出，該化合物有14個(gè)碳，其化學(xué)位移分別為δ 164.3（C-6），150.9（C-8），148.0（C-10），140.8（C-9），118.0（C-6a），115.8（C-10a），109.6（C-7），81.6（C-2），79.9（C-4），74.2（C-4），72.8（C-10），70.4（C-3），61.2（C-11）和59.5（C-12）。綜合氫譜和碳譜數(shù)據(jù)可知該化合物與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的巖白菜素一致，故將該化合物鑒定為巖白菜素，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

2.3 巖白菜素的DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

巖白菜素和維生素C對DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，巖白菜素、維生素C對DPPH均具有很強(qiáng)的清除作用，化合物濃度越高清除率越大，巖白菜素的抗氧化能力強(qiáng)于陽性對照維生素C。巖白菜素的體系終濃度IC50為0.245 μg/mL，而維生素C的體系終濃度IC50為0.575 μg/mL，從其IC50來看，巖白菜素的抗氧化活性強(qiáng)于比維生素C。

圖2 巖白菜素的核磁共振氫譜

圖3 巖白菜素的核磁共振碳譜

圖4 巖白菜素的結(jié)構(gòu)

圖5 巖白菜素對DPPH的清除曲線（n=3）

巖白菜素的抗氧化活性強(qiáng)弱與化合物結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)，其可能的抗氧化機(jī)理如圖6所示。

3 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道中華抱莖蓼的生理活性較多，其主要的活性物質(zhì)為蒽醌、綠原酸等化合物。而本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，中華抱莖蓼根中巖白菜素含量較高，該化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的體系終濃度IC50為0.245 μg/mL，低于維生素C的體系終濃度（IC500.575 μg/mL），說明巖白菜素的抗氧化活性高于維生素C，預(yù)示了富含巖白菜素的中華抱莖蓼還具有抗氧化的新活性，同時(shí)巖白菜素的較強(qiáng)抗氧化活性表明其在食品天然抗氧化劑領(lǐng)域和醫(yī)藥保健行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 巖白菜素的抗氧化機(jī)理