高產淀粉酶菌株誘變篩選及其發酵工藝的研究

桑筱筱，操燕明，楊艾玲，王敬，杜松云

（武漢華夏理工學院 生物與制藥工程學院，湖北武漢 430223）

淀粉酶是產量最大、用途最為廣泛的一種酶，在動、植物以及微生物中廣泛存在[1]。由于工業的發展，社會對該酶的需求日漸增多[2-4]。淀粉酶能催化α-1,4糖苷鍵水解，并將淀粉分解為多種重要的產物，如單糖分子、糊精等，在生活中的許多方面都有重要的用途，是工業生產中重要的一類酶[5-7]。能獲得淀粉酶的途徑有很多，可以從動物、植物、微生物中獲取，工業生產中微生物是產淀粉酶的重要來源，其應用十分廣泛，以其高效的特點著稱，幾乎已經取代了其他水解淀粉的方法。現代工業利用枯草芽孢桿菌生產淀粉酶已經處在酶制劑行業的首位[7-10]。紫外誘變是進行人工選育高產菌株最常用的方法，其方法操作簡便，成本較低，易操作。誘變育種的目的在于選育出具有優良性狀的菌株，能滿足工業生產的需求，并將其應用于工業生產之中。紫外誘變育種具有隨機性和不確定性，因此選育出的菌株所具有的性狀具有多樣性。在工業生產中要求菌株的遺傳穩定性好，相比于自然選育，紫外誘變是一種較優的選擇，選育出來的高產菌株能進一步降低生產成本[11]。本研究的意義在于通過誘變篩選出一株高產淀粉酶的菌株，為該酶的工業應用奠定一定的理論基礎。同時通過發酵培養基的優化提高產酶活力，篩選出一株高產、高效的菌株，可能會從時間、成本和人力、物力上給工業生產帶來巨大的進步。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

從武漢華夏理工學院土樣中篩選的枯草芽孢桿菌菌株。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉膏、瓊脂、NaCl等試劑，購自天津市博迪化工有限公司；碘液、糊精、磷酸氫二鈉、檸檬酸等，購自武漢欣申試化工科技有限公司。超凈工作臺（蘇州吳凈空調凈化有限公司）；臺式離心機（SIGMA）；恒溫培養箱（SHELLAB）；恒溫搖床[伊孚森生物技術（中國）有限公司]；紫外分光光度儀（上海光學儀器廠）。

1.1.3 培養基

淀粉培養基：蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏5 g/L、瓊脂2 g/L，自然pH。淀粉酶發酵培養基：牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨5 g/L、自然 pH。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

從武漢華夏理工學院一食堂附近取土壤樣品，把土樣放入燒杯加水稀釋，將土壤樣品稀釋成10-3、10-4、10-5的濃度梯度，分別涂布到淀粉培養基上，倒置培養，在27 ℃恒溫培養箱中培養2 d。根據枯草芽孢桿菌菌落特點，挑選出符合條件的單個菌落。將單個菌落保存到斜面培養基上，培養2 d后，接種到淀粉培養基上，待菌落長出后用碘液染色進行染色，記錄菌落直徑和透明圈大小，計算D/d值。

1.2.2 菌種鑒定

產酶菌株的鑒定參照文獻[12]，從菌落形態特征、革蘭氏染色、芽孢染色生理生化鑒別方面對未知菌種進行初步鑒別。

1.2.3 紫外誘變提高酶活力

本實驗采用對比微生物學中麥氏比濁管將菌懸液稀釋至104個/mL左右，采用20 W、254 nm、30 cm處紫外燈照射平板，每個平板處理的時間分別為0、2、4、6、8 min和10 min，處理完后，用保鮮膜封口后然后用報紙包好放置在27 ℃恒溫培養箱倒置培養2 d，待長出單個菌落后，計數單菌落數，代入公式計算致死率；通過碘液染色處理，分別測量單菌落的淀粉水解透明圈直徑以及菌落直徑，通過水解透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d值），選取比值最大的單菌落，接種到斜面培養基上保存。

1.2.4 優化菌株搖瓶發酵條件

按單因素實驗研究培養基pH、接種量等因素對菌株產淀粉酶的影響，每種變量3個重復。取平均酶活力值．在最優化各單因素條件下用正交實驗選擇適宜的液體發酵培養基。實驗選取接種量、淀粉含量、蛋白胨含量三因素四水平實驗，為減少任務量，經分析查閱資料得到了如下四組處理結果如表1：

表1 正交實驗表

保持實驗的其他條件不變，按正交實驗表中方式處理發酵液，每瓶100mL裝至250mL錐形瓶中，編號為1.1、1.2、1.3、1.4，在27℃恒溫箱中搖瓶培養48h。最后用分光光度計測定發酵液吸光值。

1.2.5 淀粉酶的初步提純及酶活性的測定

（1）淀粉酶的初步提純

為進一步驗證上述正交實驗所得結果，實驗進行粗酶的提取，收集上述中編號為1.1、1.2、1.3、1.4四個錐形瓶中所得發酵液，將其加入離心管中以3000r/min轉速進行離心，離心10min后，去除菌體沉淀，收集上清液。在上清液中緩慢加入冰凍乙醇，用玻璃棒輕輕攪拌，加入冰凍乙醇直到終濃度為70%，邊攪拌邊觀察底部有無沉淀析出，于4℃冰箱中鹽析，使上清液中蛋白質沉淀，放置過夜，第二天將錐形瓶取出，將溶液放入離心管中以5000r/min轉速離心20min，收集沉淀，得到粗酶。

（2） 酶活性的測定

將上述得到的初步提純的淀粉酶進行酶活性的測定，在1-6號試管中分別加入0%、0.2%、0.5%、1%、1.5%和2.0%的可溶性淀粉稀釋液，再向試管中分別各加入1mL緩沖液和1mL蒸餾水，用于標準曲線的制作。將其中編號為1.1′1.2′1.3′1.4′的各管中均加入2.0%的可溶性淀粉，加入1mL緩沖液和1mL正交實驗中各種處理結果后所得粗酶液，進行酶活力測定。40℃水浴保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混勻吸取反應液。之后向反應液中加10 mL碘液，測吸光值。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的菌落特征

該菌落形狀呈圓形，顏色為不透明乳白色，邊緣較齊整，表面光滑，易挑取，如圖1所示。

圖1 菌落特征

實驗中通過對該菌進行革蘭氏染色，用光學顯微鏡觀察，在油鏡下發現，細菌被染成紫色，符合革蘭氏陽性菌的特征，因此，初步判斷篩選得到的菌株為革蘭氏陽性菌，如圖2所示。將篩選得到的菌株芽孢染色后，在油鏡下觀察得到該菌體呈紅色，芽孢呈藍綠色，如圖3所示，可以初步判斷篩選得到的降解淀粉酶的菌為枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株的革蘭氏染色圖

圖3 菌株的芽孢染色圖

2.2 紫外誘變結果

2.2.1 紫外誘變處理

在20 W、254 nm、30 cm處紫外燈下照射平板，隨著照射時間的延長，培養基中菌落數逐漸遞減，經紫外照射處理后所得的菌落記錄如圖4所示。

圖4 紫外誘變處理結果

2.2.2 計算致死率及制作致死曲線

通過紫外誘變處理，將不同處理時間的菌株涂布平板放置在黑暗條件下培養，以未誘變菌株培養為對照，分別計算致死率，結果如表2所示，致死曲線如圖5所示。由致死曲線可以看出紫外線照射對芽孢桿菌的作用效果明顯，誘變時間為6 min時，致死率為65.10%，當誘變時間為8 min時，致死率變化基本保持不變在72.40%，為保證較高的篩選概率，選擇誘變時間為8 min時候的紫外照射劑量。

表2 致死率計算結果

圖5 紫外誘變致死曲線

2.2.3 紫外誘變單菌落D/d值

選取紫外照射為8 min時的菌落，通過碘淀粉顯色處理，得到單菌落的透明圈直徑和菌落直徑及比值，結果見表3。由表3數據可以得到，通過誘變處理后，有的菌株產酶活力有所提高，有的降低，6號菌株的D/d值最大，因此挑選6號菌將其保存到斜面培養基上供后續實驗使用。

表3 紫外誘變單菌落D/d值

2.2.4 紫外誘變突變菌株與原始菌株的對比

在相同的接種量和相同的培養基中，菌株培養48h后的突變株與野生菌株透明圈如圖6所示。在平板培養基上可以看出，菌落顏色均為乳白色，邊緣齊整，表面光滑，菌落大體形狀均為圓形。突變菌株與野生菌株較不同的是前者的菌落顏色稍淺于后者，生長周期長，邊緣稍有突起，出現透明水解圈所花時間長。但出現的水解圈大小突變菌株明顯大于野生菌株。

在斜面培養基上可以看出，突變株菌株松散，生長周期緩慢，而野生菌株菌落結實，生長周期較快。突變菌株與野生菌株D/d值見表4，通過碘淀粉顯色處理，突變菌株的D/d值明顯高于野生菌株的D/d值，因此，突變菌株的水解淀粉的能力較強。

圖6 突變菌株與野生菌株

表4 突變菌株與野生菌株D/d值

2.3 搖瓶培養結果

2.3.1 pH值和裝液量對菌株產酶能力的影響

根據所測吸光值顯示，當pH為5，裝液量為30%時，所測吸光值為0.276最大，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，表明在該條件下酶活性最強，由此確定實驗室搖瓶培養的最佳條件：pH為7，裝液量為40%，結果見表5。

表5 pH值和裝液量對產酶的影響

2.3.2 碳源種類對菌株產酶能力的影響

由表6可知，當碳源為葡萄糖時，其吸光值為1.375最大，表明在該條件下菌株活力最強。

表6 碳源種類對產酶的影響

2.4 正交實驗結果

由表7正交實驗所測吸光值可得，編號為1.1的所測吸光值最大，表明在該條件下酶活性最強，由此確定實驗室搖瓶培養最佳結果為編號1.1處理。

表7 正交實驗所測吸光值

2.4.1 標準曲線制作及酶活性測定結果

通過分光光度計測量得到表8數據：

表8 酶活性測定

由表8前6組數據繪制酶活性曲線，如圖7所示。

圖7 淀粉標準曲線

正交實驗酶活力的測定結果見表9。

表9 正交實驗酶活力測定

由表9數據可得，1.1號試管的酶活力最強，得到最佳配方為接種量3%、淀粉含量5 g/L、蛋白胨含量5 g/L。

2.5 誘變菌株與野生菌株酶活力的對比

野生菌株所測吸光值A660為1.220，經計算可得其酶活力為8.28 mg/mL·h，誘變菌株酶活力為10.24 mg/mL·h，結果可知經紫外誘變和培養基配方的優化，酶活力提高了1.96 mg/mL·h，產酶活性比出發菌株高出23.7%。

3 討論

目前對淀粉酶篩選有許多方法，最常用的方法有通過碘液染色法，在淀粉培養基上通過透明圈的大小和菌落直徑，確定D/d值，從中篩選出水解淀粉的菌株。但碘液染色法應用于淀粉酶生產菌的篩選具有一定的局限，根據淀粉水解圈的大小來判斷菌株產酶活力的高低，有時也不一定完全對應。因此，此方法只能用在初篩產淀粉菌株的篩選中。酶活力的大小的測定不能簡單通過透明水解圈的大小來進行判斷，應通過更為準確的方法獲得。原因有可能是培養平板得透明圈是固體狀態，而酶活則是在液體狀態下測定，因此，產酶菌株在固態和液態兩種狀態下反應結果會有所不同。

在土壤中存在不同的產淀粉酶菌株，但產酶活力較低，因此，眾多科研工作者在提高產酶活力方面做了許多研究。一般采用傳統的誘變方法來提高酶活，比如加化學誘變劑或物理誘變等方法。產淀粉酶菌株多數將酶分泌到細胞外，但也有一些是分泌到細胞內，對于胞外酶一般采用化學、物理或酶降解法去除細胞壁，釋放出細胞內酶，進而提高酶活力。本試驗中篩選得到的淀粉酶其酶活性僅提高了23.7%，幅度還不夠大，因此，有待于通過基因工程技術對菌株進行改造以提高酶活力。