苦瓜中α-葡萄糖苷酶抑制劑的超濾質譜篩選研究

郭力菲，侯萬超，趙婉伊，趙紅磊，牛俊博，宋吉玲，孫鳴悅，何文麗，劉春明＊

（長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032）

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種臨床常用的口服降糖藥物，它能夠抑制小腸內α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內的吸收，從而達到降低餐后高血糖的作用[1-2]。目前，從天然藥物或者植物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究已成為熱點。苦瓜（Momordica charantia）為葫蘆科苦瓜屬植物，其根、莖葉及果實皆可入藥，具有清熱解毒的作用[3]。苦瓜果實也是一種經常食用的蔬菜，很多文獻報道其化學成分具有很好的降血糖功效[4-6]。董義研究了6種保健食品原料的降糖效果，認為苦瓜的降糖效果最好[7]。彭曉赟等[8]研究了苦瓜根總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶活性的作用，并得到α-葡萄糖苷酶抑制活性最好的皂苷提取工藝。劉慧娟等[9]研究了7種苦瓜皂苷單體化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，證明皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物質基礎。從苦瓜提取物中篩選出有效的活性成分，不僅能了解其降糖機制，還能為尋找新的治療糖尿病藥物提供實驗基礎。

超濾質譜技術是將超濾技術與質譜技術結合的一種藥物篩選方法[10-11]，主要是利用親和原理將含有潛在活性的小分子物質與受體混合，形成復合物，通過超濾膜濾去未結合的小分子物質，以有機溶劑處理釋放小分子配體，并采用液相-質譜聯用技術進行鑒別。該方法具有分析速度快、無需預處理過程等優點，在藥物篩選過程中具有廣闊的應用前景。

本研究選擇α-葡萄糖苷酶作為藥物靶點，利用離心超濾和液相色譜-質譜聯用的方法，從苦瓜提取物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，并利用LC-MS技術對篩選出的活性成分進行結構鑒定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Agillent 1260 Infinity型高效液相色譜儀，配備UV檢測器（Agillent，美國）；Q Extractive 質譜儀（）hermo Scientific，美國）；3-30K高速冷凍離心機（Sigma，德國）；G3旋轉蒸發儀（Heidolph，德國）；THZ-D恒溫振蕩器（大倉市實驗設備廠）；Integrel 3超純水儀（Millipore，美國）。

苦瓜片，購自中東萬家醫藥超市（長春）；α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, 100U），購自美國sigma公司；YM-10型Microcon超濾管，購自美國Millipore公司；醋酸銨（分析純），購自天津科密歐試劑有限公司；乙腈（HPLC），購自美國Fisher公司；甲醇（分析純），購自北京化工廠；實驗用水為Millipore超純水。

1.2 樣品處理

取自然風干的苦瓜片，用粉碎機粉碎過60目篩。準確稱取10.0g苦瓜干粉，按料液比1∶10加甲醇回流提取1h，過濾后，濾渣進行同樣條件的二次提取，將兩次提取的濾液合并濃縮至樣品濃度為0.5 g/mL，過0.45μm濾膜，待用。

1.3 離心超濾篩選方法

分別移取50 μL 0.5 g/mL苦瓜提取物溶液和25 μL 1.0 U α-葡萄糖苷酶溶液，加入925 μL pH=6.8的10 mmol/L 的醋酸溶液中，置于37 ℃恒溫振蕩器中反應40 min，移取800 μL至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，于14000 r/min下超速離心30 min，向濾膜中加入100 μL 10 mmol/L的醋酸溶液（pH=6.8），離心清洗3次，洗去未結合成分。再向濾膜中加入100 μL甲醇（pH=3.3），在14000r/min下離心30min釋放結合配體，重復2次，收集洗脫液，用于LC-MS分析。不加α-葡萄糖苷酶的空白實驗處理方法同上。

1.4 LC-MS分析條件

色譜柱：5μm, 250mm×4.6mm；流動相：乙腈-水梯度洗脫（0min，40%乙腈；2min，60%乙腈；40min，100%乙腈；50min，100%乙腈）。流速：0.8mL/min。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；噴霧電壓：3.3kV；鞘氣流速：40psi（1 psi≈6.9 kPa）；輔助氣流速：10 psi；毛細管溫度320℃；輔助氣溫度320 ℃；S-Lens分辨率：50；掃描范圍：m/z150～2000Da；質量分辨率：70000。

2 結果與討論

2.1 苦瓜化學成分與α-葡萄糖苷酶生物親和作用研究

苦瓜提取物與α-葡萄糖苷酶作用和與不加α-葡萄糖苷酶的空白實驗的高效液相色譜圖如圖1所示。當苦瓜提取物中的化學成分與α-葡萄糖苷酶發生特異結合后，α-葡萄糖苷酶捕獲的配體所對應的峰面積均大于其空白對照。圖1表明，苦瓜提取物中有5個化學成分與α-葡萄糖苷酶結合。

通過分別對比5個化合物在兩種不同實驗條件下的液相色譜圖1a和圖1b，考察化合物與α-葡萄糖苷酶的結合能力，結果如圖1所示。由圖1可知，在控制變量保證其它實驗條件相同的情況下，該5個化合物與α-葡萄糖苷酶作用和與不加α-葡萄糖苷酶的空白實驗的液相色譜比值明顯較大。因此由圖1a和圖1b可推測該5個化合物與α-葡萄糖苷酶具有結合作用，可以抑制α-葡萄糖苷酶生物活性，具有潛在的2型糖尿病活性。

圖1 苦瓜提取物的離心超濾HPLC圖(a-與α-葡萄糖苷酶作用、b-空白試驗)

2.2 液相色譜-質譜聯用分析和結構鑒定

根據超濾親和篩選出的5種化合物的保留時間和特征離子峰（表1），結合參考文獻進行解析，結果見圖2。

化合物1（tR25.86 min）的ESI-MS圖譜顯示，m/z 687.38[M+K]+，m/z 671.32[M+Na]+，由此判斷該化合物的相對分子量為648。苦瓜皂苷K的分子式為C37H60O9，計算其相對分子質量為648，與此質譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 666.46[M+H2O]+,m/z 437[M+H-162-H2O-CO2]，其中162代表失去一個葡萄糖基，進一步確定了該化合物的結構[9]。

化合物2（tR31.56min）的ESI-MS圖譜顯示，m/z 511.32[M+K]+, m/z 495.34[M+Na]+，由此判斷該化合物的相對分子量為472。苦瓜素I的分子式為C30H48O4，計算其相對分子質量為472，與此質譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 437.34[M+H-2H20]+，m/z 419.33[M+H-3H2O]+進一步確定了該化合物的結構[12]。

化合物3（tR32.98min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 671.39[M+K]+, m/z 655.34[M+Na]+, 633.44[M+H]+，計算其相對分子質量為632。苦瓜皂苷G的分子式為C37H60O8，計算其相對分子質量為632，與此質譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 471.38[M+H-162]+，m/z 439.36[M+H-162-CO2]+，進一步確定了該化合物的結構[6]。

化合物4（tR34.50min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 701.40[M+K]+，m/z 685.43[M+Na]+，計算其相對分子質量為632。未能找到與之對應的化合物。

化合物5（tR35.88min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 525.33[M+K]+，m/z 509.36[M+Na]+，m/z 633.44[M+H]+，計算其相對分子質量為486。查閱文獻發現，(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol和 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol的分子式為C31H50O4，理論分子質量為486，與此質譜信息吻合[13]。

表1 苦瓜提取物中的活性成分鑒定

3 結論

通過超濾-質譜方法從苦瓜提取物中篩選出5種具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化學成分，其中4種經初步鑒定為苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol），1種暫未確定其結構。本研究為進一步開發基于苦瓜的降糖產品提供了依據。

圖2 化合物1～5的質譜數據

（a、b、c、d、e依次為苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、未知、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol）