紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙的標準不確定度

趙娟

（寧夏回族自治區食品檢測研究院，寧夏銀川 750001）

甙亦稱為苷，是一種廣泛存在于植物中的化合物，其中淫羊藿苷是黃酮類化合物含量最高的淫羊藿單體分離化合物[1]。淫羊藿苷具有抗衰老、抗氧化、抗抑郁等藥理作用，在婦科疾病方面也有潛在的價值[2]，羊胎盤膠囊是為女性研制的有抗衰老，抗色斑功效的保健食品，目前，紫外分光光度法是測定羊胎盤膠囊中總甙含量的地方標準方法。該方法于2017年發布，2018年實施。本試驗以研究紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中的總甙為例子，依據標準JJF10591.1-2012《測量不確定度評定與表示》[3]，列出總甙計算公式為數學模型，對本實驗全部實驗過程中所引入的不確定度的分量，逐個進行測量以及評定，為最終標準不確定度的評定提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用設備、溶液、試劑

紫外分光光度計（日本島津）；BS224電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；高速離心機（黑龍江龍澤科技發展有限公司）；超聲振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）。

淫羊藿苷對照品溶液，購自：中國藥品生物制品檢定所；羊胎盤膠囊，購自寧夏自然生物科技有限公司；甲醇（分析純）；無水乙醇（分析純）；乙醚（分析純）；實驗過程所用水均為RO水。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取經五氧化二磷干燥器或減壓干燥24h的淫羊藿苷對照品10mg，用甲醇溶解定容至10.0mL，即得每毫升含淫羊藿苷1.0mg標準溶液，吸取上述對照品溶液1.0mL，用甲醇定容至10.0 mL，即得0.1mg/mL淫羊藿苷對照品的使用液。精密吸取淫羊藿苷對照品使用液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5mL和4.0mL分別至于10mL容量瓶中，以70%乙醇，定容。則標準曲線絕對含量分別為0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和0.40 mg。搖勻后用紫外分光光度計在270 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3 實驗方法

取試樣至少30粒（約1 g/粒）的內容物于干凈容器中，混勻后待測。準確稱取混勻后的試樣0.50 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙醚振搖3 min。4 000 r/min離心5 min，棄去上層乙醚，如此反復3次除去干擾雜質；揮干試樣中的乙醚后，加入50 mL70%乙醇放入超聲波震蕩器中震蕩提取40 min，冷卻后定容至50.0 mL過濾。吸取濾液1.0 mL用70%乙醇定容至10.0 mL，搖勻，即得試液。取上述試液在270 nm波長處測定其吸光度，以70%乙醇為空白對照測定。

1.4 數學模型的建立

羊胎盤膠囊中總甙含量的測定根據DB64/T1515-2017《羊胎盤膠囊中總甙含量測定 紫外分光光度法》：

式中：X為試樣中總甙（以淫羊藿甙計）含量，g/100 g；C為試樣供試品從標準曲線中查得的含量，mg；m為試樣質量，g。

1.5 產生不確定度的各個分量

有多個因素隨機影響羊胎盤膠囊中總甙含量，主要包括以下兩個方面。（1）紫外分光光度計與定容體積的隨機系統性誤差、天平的穩定性、樣品制備中的均勻度、實驗個體的差別、實驗環境的改變以及回收率的不確定性等因素所引入的測量不確定度。（2）稱量淫羊藿苷對照品、標準溶液的稀釋和定容、測定樣品總甙含量（隨機變化）的重復性及曲線的不確定度等因素所引入的測量不確定度。

2 結果與分析

2.1 標準對照品溶液不確定度

2.1.1 稱量過程引入的不確定度

標準對照品的稱樣量為0.01 g，標準中天平要求的最小分度為0.01 g。標準JJG 1036-2008《電子天平檢定規程》中規定，此精度的天平在-10～50 000 mg范圍稱量，其MPE為±0.5e(e=1.0 mg)，兩次稱量：空瓶mtare、樣品msamp，所得為對照品質量，線性MPE（天平）為矩形分布[4]，天平稱量中兩次的MPE引入的不確定度

得到：

2.1.2 溶液定容體積所引入的不確定度

定容體積為10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（單標線）的允許誤差為±0.020 mL，假定其為三角分布，則校準過程中導致的標準不確定度：

2.1.3 稀釋過程引入的不確定度

用5 mL的單標線吸管吸取5.0 mL 1.0 mg/mL對照品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容，此溶液為淫羊藿苷對照品使用液，濃度0.1 mg/mL。再用5 mL分度吸管吸取淫羊藿苷對照品使用液0.5、1.0、2.0、3.0、3.5 mL 和 4.0 mL，定容至 10 mL，則標準曲線絕對含量分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和 0.40 mg。

標準溶液配置的過程中所使用的玻璃量具，以JJC 196-2006《常用玻璃量具檢定規程》中要求的最大允差，以三角分布，k= 6，由此推出相對不確定度的各個分量[5]，見表1。

由上述數據合成的相對標準不確定度uCrel：

表1 標準溶液曲線配制中所使用的量具校準引入的不確定度

2.1.4 標準物質引入的不確定度

2.2 得出的樣品質量濃度時引入的不確定度（標準曲線校準以最小二乘法擬合）

淫羊藿苷對照品使用溶液標準系列，用紫外分光光度計測定得到相應的吸光度A，進行擬合（最小二乘法），得到其直線方程y=ax+b(a：斜率，b：截距)和標準曲線相關系數（r），見表2。

表2 最小二乘法擬合熒光強度值結果

本實驗過程進行了10次樣品測定液的平行測定，淫羊藿苷對照品使用溶液的平均質量濃度由直線方程求為X0=0.279 mg，則X0的標準不確定度

n為淫羊藿苷對照品使用溶液的測量次數，本例為18；

p為X0的測量次數，本例為10次。

2.3 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.1 取樣

本實驗依照DB 64/T1515-2017《羊胎盤膠囊中總甙含量測定 紫外分光光度法》測定羊胎盤膠囊中總甙含量規定，隨機稱取充分混勻后的羊胎盤膠囊，我們認為樣品是在均勻、有充分代表性的情況下稱量，由此所引入的不確定度可以忽略不計。

2.3.2 稱重

用最小分度0.1 mg的電子天平稱取混勻后的樣品0.50 g，根據JJG 1036-2008《電子天平檢定規程》中的規定，該精度的天平在-10～50 000 mg稱量范圍,其MPE：±0.5e(e=1.0 mg)，兩次稱量：空瓶mtare、樣品msamp，所得為樣品質量， 線性MPE（天平）為矩形分布，天平稱量中兩次的MPE引入的不確定度

2.3.3 定容體積所引入的標準不確定度

定容體積為10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（單標線）的允許誤差：±0.020 mL，假定其為三角分布，則校準過程中導致的標準不確定度：

2.3.4 樣品制備過程引入的不確定度

2.4 本實驗所測量的重復性的相對標準不確定度

在實驗重復性條件的前提下，對羊胎盤膠囊中總甙含量進行10次獨立性實驗測試，其測量所得數據見表3。

表3 羊胎盤膠囊總甙含量獨立測定10次實驗數據

10次測定總甙含量（重復性條件下），其算數平均值為：

單次測量的標準偏差為：

3 所引入的不確定度分量

各不確定度分量見表4。

表4 羊胎盤膠囊總甙含量不確定度分量

4 合成標準不確定度

5 擴展不確定度

取包含因子k=2，被測量之值的大于95%可包含于此區間。則擴展不確定度：U(Y)=k×Uc(Y)=2×5.66=11.4 g/100 g，相對擴展不確定度：Urel(Y)=U(Y)/96.4×100%=11.8%

則用紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙含量，對兩份樣品平行測定取平均值()的報告，擴展不確定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2，相對擴展不確定度：11.8%

6 結論

本試驗采用紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙的含量，對標準物質的稱量、標準溶液的配制、標準曲線的擬合、測量的重復性等要素所引入的不確定度等因素的不確定度評定，得出紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙含量方法擴展不確定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2。其中標準溶液的校準、樣品制備的過程、曲線最小二乘法擬合對不確定度影響比較大，在以后的試驗操作中可通過對樣品充分混勻，增加實驗測定的次數等方法來減少引入的不確定度。