虎掌南星化學成分及其抑菌活性

潘 多， 張慧茹， 曹美嬌， 單國順， 劉曉月， 高 慧， 許 枬

（遼寧中藥大學藥學院， 遼寧 大連 116600）

天南星應用歷史悠久， 為常用中藥， 其性溫，味苦、 辛， 有毒， 具燥濕化痰、 祛風定驚、 消腫散結之功效， 用于治療頑痰咳嗽、 風疾眩暈、 中風、口眼歪斜、 半身不遂、 癲癇、 驚風、 破傷風等疾病[1］， 近年來研究發現它有良好的抗宮頸癌、 抗氧化、 止咳等作用[2］。 但由于歷代本草記載的不一致， 加之同科屬植物在形態上相似及各地民間用藥習慣不同， 導致該藥材來源十分混亂[2］。 目前《中國藥典》 收載的天南星是天南星屬植物， 但唐代以前本草著作中記載的都是半夏屬植物虎掌南星， 也稱掌葉半夏Pinellia pedatisecta Schott， 首載于我國現存最早的本草著作《神農本草經》 中，列為下品[3］； 天南星之名始見于唐代 《圖經本草》[4］， 《開寶本草》 《證類本草》 中天南星和虎掌之名同用[5-6］， 因此， 有很多學者提出將虎掌南星作為天南星的來源之一， 或在藥典中增加其條目。 據市場調查， 目前國內的栽培品種和商品天南星的主流均為虎掌南星[2，7］， 課題組調查發現很多廠家生產膽南星時也使用虎掌南星作為原料。 為更好地揭示天南星的物質基礎， 確保其臨床療效， 本實驗對虎掌南星的化學成分及其活性進行研究， 從中分離得到10 個化合物， 均首次從該植物中分離得到， 而且4、 7 有較強的抗菌活性。

1 材料

Bruker AVANCE-600 超導核磁共振儀（德國布魯克公司）； Agilent Technologies 6490 質譜儀（美國Agilent 公司）； Finnigan VoyagerGC／MS 聯用儀（美國菲尼根質譜公司）； Sephadex LH-20 凝膠（瑞士法瑪西亞公司）； CHP 20P 型MCI 凝膠（日本三菱公司）； 柱色譜用硅膠（100 ～200 目， 青島海洋化工有限公司）； ODS-C18（50 μm， 日本富士化學有限公司）； TLC 薄層板（德國默克公司）。所用試劑均為分析純 （天津科密歐試劑有限公司）； 色譜純甲醇（美國天地公司）； 純凈水（娃哈哈集團有限公司）； 氘代試劑（北京恒思公司）；顯色劑為5%香草醛-濃硫酸溶液（自制）。 虎掌南星購于河北安國藥材市場， 經遼寧中醫藥大學賈天柱教授鑒定為正品。

2 提取與分離

取虎掌南星10 kg， 加乙醇浸泡提取2 周， 收集提取液， 減壓回收溶劑， 460 g 浸膏加水混懸，氯仿萃取， 減壓回收溶劑， 得氯仿萃取物235 g 及剩余水層。 抑菌實驗顯示， 虎掌南星的氯仿萃取物有明確的抑菌作用， 故取230 g 經硅膠柱， 以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0、 50 ∶1、 25 ∶1、 10 ∶1、5 ∶1） 梯度洗脫， 經硅膠薄層檢識， 合并相同斑點的流份， 得6 個組分（Ⅰ～Ⅵ）。 其中組分Ⅱ（12.3 g） 經硅膠柱， 以環己烷-乙酸乙酯（80 ∶20） 洗脫， 得化合物1 （40.5 mg）； 組分Ⅱ（55.2 g） 反復經硅膠柱及ODS 柱， 得化合物2 （20.0 mg）、 3 （15.0 mg）； 組分Ⅲ（43.4 g） 經MCI 柱、ODS 柱 純 化 后， 再 經 HPLC， 以 甲 醇-水 溶 液（90 ∶10） 洗脫， 得化合物4 （21.2 mg）、 5 （11.6 mg）、 6 （12.9 mg）、 7 （18.5 mg）、 8 （18.2 mg）、 9 （19.0 mg）； 組分V （40.7 g） 經MCI 柱純化后， 再經ODS 柱， 以甲醇-水（72 ∶38） 洗脫， 得化合物10 （40.5 mg）。

3 結構鑒定

化合物1： 無色粉末。 Liebermann-Burchard 反應為污綠色， 提示其為甾體類化合物。 采用TLC分析， 以3 種色譜系統檢識， 經與β-谷甾醇對照發現Rf值相同， 故鑒定為β-谷甾醇。

化合物2： 無色粉末。 ESI-MS m／z： 279 [M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDOD3） δ： 7.71 （2H，m， H-3， 4）， 7.60 （2H， m， H-2， 5）， 4.29 （4H，t， J=6.6 Hz， H-1′）， 1.71 （4H， p， J=7.3， 6.6 Hz， H-2′）， 1.45 （4H， h， J = 7.3， 6.6 Hz， H-3′）， 0.95 （6H， t， J = 7.3 Hz， H-4′）；13C-NMR（150 MHz， CDOD3） δ： 12.6 （C-4′）， 18.8 （C-3′）， 30.3 （C-2′）， 65.2 （C-1′）， 128.5 （C-3，4）， 130.9 （C-2， 5）， 132.2 （C-1， C-6）， 167.9（-COO）。 以上數據與文獻[8］ 基本一致， 故鑒定為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物3： 無色粉末。 Liebermann-Burchard 反應為污綠色， Molish 反應陽性， 提示其為甾體苷類化合物。 采用TLC 分析， 以3 種色譜系統檢識，經與胡蘿卜苷對照品比對發現Rf值相同， 故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物4： 無色粉末。 ESI-MS m／z： 755 [M＋H］＋。1D-NMR 譜數據顯示結構中有1 個糖和長碳鏈片段， 提示其為糖脂類化合物[9］。1H-NMR 譜中，觀察到δ 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz）， 4.53 （1H，d， J=3.0 Hz）， 4.41 （2H， m）， 4.11 （1H， dd，J=3.0， 9.4 Hz）， 4.03 （1H， m） 質子；13C-NMR中 觀 察 到 δ 105.7， 77.1， 75.2， 72.2， 70.0，62.0 的碳信號及1H-NMR 中糖質子的J1 ‘2’ =7.7 Hz （diaxial） 和J3 ‘4’ =3.0 Hz （axial-equatorial）， 表明4 中的糖基為β-D-吡喃半乳糖基[9］。由1H-NMR 譜中觀察到1 個ABMXY 自旋系統δ 5.64 （1H， m）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz）， 4.49 （1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz）， 4.33（1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz）， 4.03 （2H， m），13C-NMR譜中觀察到3 個連氧碳信號δ 71.0， 68.0，63.2， 表明該化合物結構中有1 個甘油基。 2 個酰基的羰基碳信號分別出現在δ 1 753.7 和173.1，特征質子信號如δ 2.89 （2H， m）， 2.08 （4H，m）， 1.61 （4H， m）， 1.32 （4H， m）， 0.84 （6H，t， J=6.7 Hz） 分別為鄰接雙鍵的亞甲基， 鄰接羰基的亞甲基以及末端甲基信號， 雙鍵的構型根據碳譜中鄰接雙鍵的亞甲基碳信號δ 27.5， 27.4 確定為順式[9］。 將1 用10% NaOMe-MeOH 堿水解， 產物經GC-MS 分析證明酰基部分為十六烷酰基和亞油酰基， 兩者比為1 ∶1， 綜上所述， 推定1 的結構為（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-亞油酰基- 3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油。1H-NMR （600 MHz， pyridined6） δ： 5.64 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1?）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， brd， J = 3.3 Hz， H-4?）， 4.49 （1H，dd， J=5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2?， 6?）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a）， 4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3?），4.03 （2H， m， H-5?， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （4H， m，H-8′，14′）， 1.61 （4H，m，H-3′，3″）， 1.32 （4H，m， H-15′， 13″）， 1.24 （34H， m， H-4′～7′， 16′，17′， 4″～12″， 14″， 15″）， 0.84 （6H， t， J=6.7 Hz，H-16″， 18′）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d6） δ：63.0 （C-1）， 68.0 （C-3）， 71.0 （C-2）， 174.0，173.7 （ C-1′， C-1″）， 34.4， 34.2 （ C-2′， 2″），25.2 （ C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～13″， 4′～7′， 15′），27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 128.7，128.3 （C-9′， C-10′， C-12′， C-13′）， 26.0 （C-11′）， 32.1， 31.6 （ C-16′， 14″）， 22.9， 22.8（C-17′， 15″）， 14.3， 14.2 （C-18′， 16″）， 105.7（C-1?）， 72.2 （C-2?）， 75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1 （C-5?）， 62.0 （C-6?）。 以上數據與文獻[10］ 基本一致， 故鑒定為（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-亞油酰基-3-O- β-D-半乳糖基甘油。

化合 物5： 無 色 粉 末 狀。 ESI-MS m／z： 753[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （6H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′， 9″， 10″）， 4.78 （1H， d， J =7.7 Hz， H-1?）， 4.66 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz，H-1a）， 4.53 （1H， d， J = 3.3 Hz， H-4?）， 4.49（1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H，m， H-2?， 6?）， 4.33 （1H， dd， J=5.3， 10.8 Hz，H-3a）， 4.11 （1H， dd， J=3.3， 9.4 Hz， H-3?），4.03 （2H， m， H-5?， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （8H， m，H-8′， 14′， 8″， 11″）， 1.61 （4H， m， H-3′， 3″），1.32 （4H， m， H-15′， 13″）， 1.24 （32H， m， H-4″～7″， 4′ ～7′， 16′， 17′， 12″， 13″， 14″， 15″），0.84 （6H， t， J = 7.7 Hz， H-16′， 18″）；13C-NMR（150 MHz， pyridine-d5） δ： 63.0 （C-1）， 71.0（C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （C-1′， C-1″），34.4， 34.2 （C-2′， 2″）， 25.2 （C-3′， 3″）， 30.0，29.9， 29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～7″， 12″， 13″， 4′～7′， 15′）， 27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 130.2， 130.1， 128.7，128.3 （ C-9′， C-10′， C-12′， C-13′， 9″， 10″），32.1， 31.6 （C-16′， 14″）， 22.9， 22.8 （C-17′，15″）， 14.3， 14.2 （C-18′， 16″）， 105.7 （C-1?），72.2 （C-2?）， 75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1（C-5?）， 62.0 （C-6?）。 該化合物經堿水解及GCMS 分析證明酰基為亞油酰基和9Z-十六烷酰基，二者比例1 ∶1。 以上數據與文獻[11-12］ 基本一致， 故鑒定為diacylgalactolipid Ⅰ。

化合 物6： 無 色 粉 末 狀。 ESI-MS m／z： 783[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1?）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4?）， 4.49 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2?，6?）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3?）， 4.03（2H， m， H-5?， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′），2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （4H， m， H-8′，14′）， 1.61 （4H， m， H-3′， 3″）， 1.32 （4H， m，H-15′， 15″）， 1.24 （42H， m， H-4″～15″， 4′～7′，16′， 16″， 17′， 17″）， 0.84 （6H，t，J=7.7 Hz，H-18′， 18″）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d5） δ：63.0 （C-1）， 71.0 （C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （ C-1′， C-1″）， 34.4， 34.2 （ C-2′， 2″），25.2 （ C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～15″， 4′～7′， 15′），27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 128.7，128.3 （C-9′， C-10′， C-12′， C-13′）， 32.1， 31.6（C-16′， 16″）， 22.9， 22.8 （C-17′， 17″）， 14.3，14.2 （C-18′， 18″）， 105.7 （ C-1?）， 72.2 （ C-2?）， 75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1 （C-5?），62.0 （C-6?）。 該化合物經堿水解及GC-MS 分析證明酰基為亞油酰基和十八烷酰基， 二者比例1 ∶1。以上數據與文獻 [10］ 基本一致， 故鑒定為（2S） -1-O-十八碳酰基-2-O-亞油酰基-3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合 物7： 無 色 粉 末 狀。 ESI-MS m／z： 779[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.63 （1H， m， H-2）， 5.47 （8H， m， H-9′， 9″，10′， 10″， 12′， 12″， 13′， 13″）， 4.79 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1?）， 4.66 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz，H-1a）， 4.53 （1H， d， J = 3.3 Hz， H-4?）， 4.49（1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H，m， H-2?， 6?）， 4.33 （1H， dd， J=5.3， 10.8 Hz，H-3a）， 4.11 （1H， dd， J=3.3， 9.4 Hz， H-3?），4.03 （2H， m， H-5?， H-3b）， 2.89 （4H， m， H-11′， 11″）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （8H，m， H-8′，8″，14′，14″）， 1.61 （4H， m， H-3′，3″），1.32 （ 4H， m， H-13′， 13″， 15′， 15″）， 1.24（24H， m， H-4′～7′， 4″～7″， 16′， 16″， 17′， 17″），0.84 （6H， t， J = 7.7 Hz， H-18′， 18″）；13C-NMR（150 MHz， pyridine-d5） δ： 63.0 （C-1）， 71.0（C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （C-1′， C-1″），34.4， 34.2 （C-2′， 2″）， 25.2 （C-3′， 3″）， 30.0，29.9， 29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～7″， 4′～7′， 15′， 15″）， 27.5， 27.4 （C-8′， 8″，14′， 14″）， 26.0 （C-11′， 11″）， 130.4， 130.3，128.7， 128.3， 127.4 （C-9′， 9″， 10′， 10″， 12′，12″， 13′， 13″）， 31.6 （C-16′， 16″）， 22.8 （C-17′， 17″）， 14.2 （C-18′， 18″）， 105.7 （C-1?），72.2 （C-2?）， 75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1（C-5?）， 62.0 （C-6?）。 該化合物經堿水解及GCMS 分析證明酰基為亞油酰基。 以上數據與文獻[13-14］ 基本一致， 故鑒定為（2S） -1， 2-雙-亞油酰基-3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合 物8： 無 色 粉 末 狀。 ESI-MS m／z： 703[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 4.82 （1H， d， J=7.7 Hz，H-1?）， 4.67 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.56 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4?）， 4.52 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.44 （3H， m， H-2?，6?）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.14 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3?）， 4.07（2H， m， H-5?， H-3b）， 2.31 （4H， m， H-2′， 2″），1.61 （4H， m， H-3′， 3″）， 1.32 （4H， m， H-15′，15″）， 1.21 （48H， m， H-4″～15″， 4′～15′）， 0.78（6H， t， J= 7.7 Hz， H-16′， 16″）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d5） δ ： 63.2 （C-1）， 71.0 （C-2），68.0 （C-3）， 173.3， 173.1 （C-1′， C-1″）， 34.3，34.1 （C-2′， 2″）， 25.1 （C-3′， 3″）， 30.0， 29.9，29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～14″，4′～14′）， 22.9， 22.8 （C-15′， 15″）， 14.3， 14.2（C-16′， 16″）， 105.7 （ C-1?）， 72.2 （ C-2?），75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1 （C-5?）， 62.2（C-6?）。 該化合物經堿水解及GC-MS 分析證明酰基為十四碳酰基和十六碳酰基， 二者比例1 ∶1。以上數據與文獻 [14］ 基本一致， 故鑒定為（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-十四碳酰基- 3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合 物9： 無 色 粉 末 狀。 ESI-MS m／z： 493[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1?）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4?）， 4.49 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2?，6?）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3?）， 4.03（2H， m， H-5?， H-3b）， 2.32 （2H， m， H-2′， 2″），2.08 （4H， m， H-8′， 14′）， 1.61 （4H， m， H-3′，3″）， 1.21 （24H， m， H-4′～15′）， 0.84 （3H， t，J=7.7 Hz， H-18′）；13C-NMR （150 MHz， pyridined5） δ： 63.2 （C-1）， 71.0 （C-2）， 68.0 （C-3），173.5， 173.1 （C-1′， C-1″）， 34.3， 34.1 （C-2′，2″）， 25.1 （C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～16″， 4′～7′， 16′），22.8 （C-17′， 17″）， 14.2 （C-18′， 18″）， 105.7（C-1?）， 72.2 （C-2?）， 75.2 （C-3?）， 70.0 （C-4?）， 77.1 （C-5?）， 62.2 （C-6?）。 該化合物經堿水解及GC-MS 分析證明酰基為十四碳酰基和十六碳酰基， 二者比例1 ∶1。 以上數據與文獻[15］基本一致， 故鑒定為spongilipid。

化合物10： 無 色 油 狀 物。 EI-MS： m／z 93[M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CD3OD） δ： 3.60（2H， dd， J=4.9， 11.3 Hz）， 3.53 （2H， dd， J=6.1， 11.3 Hz）， 3.67 （1H， m）；13C-NMR （150 MHz， CD3OD） δ： 62.3， 73.8。 以上數據與文獻[16］ 基本一致， 故鑒定為丙三醇。

4 抑菌實驗

將化合物4、 7 加無菌水分別制成0.1 mg／mL溶液， 取適量與熔化的瓊脂混勻， 制成系列濃度含藥瓊脂平板， 受試菌分別接種于含藥平板上， 測定化合物的最低抑菌濃度（平行3 次， 用青霉素做對照）。 結果， 化合物4、 7 對金黃色葡萄球菌、 黑曲霉菌、 幽門螺旋桿菌有抑制作用， 化合物4、 7 的MIC （最小抑菌濃度） 分別為20、 30、 50 μg／mL，25、 50、 150 μg／mL； 青霉素對黑曲霉菌無明顯抑制作用， 對金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌有抑制作用， 其MIC 分別為0.4、 4.0 μg／mL。

5 討論

糖脂類成分具有抗炎、 抑菌、 抗腫瘤等多種活性[13］， 因其性質相似， 分離比較困難。 其結構研究的重點是C-2 構型、 脂鏈結構、 連接位置的確定， 脂鏈結構常用的鑒定方法是堿水解， 得到甘油糖苷和脂鏈， 然后對脂鏈部分進行甲基化， GC／GC-MS 分析， 鑒定脂鏈結構； 脂鏈連接位置常用酶解法確認[14］； 糖基部分可以采用酸水解的方法，得到的糖基再采用色譜或光譜分析鑒定[14］。 因本研究所分離化合物均為已知成分， 而且量較少， 故未做酶解和酸水解。

傳統理論認為， 天南星具有豁痰作用， 可有效治療痰熱壅肺之癥， 如氣管炎、 肺炎等病， 而且這類疾病又常伴有細菌感染。 本研究發現， 化合物4、 7 具有抑制金黃色葡萄球菌、 黑曲霉、 幽門螺旋桿菌生長的作用， 提示糖脂類成分可能是其活性物質之一。