登革熱動物模型研究進展

陳 倩，鮑琳琳，王 衛

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，衛健委人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

理想的登革病毒感染動物模型是登革熱防治研究的基礎平臺之一。研究表明，登革病毒可感染部分實驗動物，如實驗小鼠和恒河猴等，但要建立動物模型，均存在一些缺陷。例如，登革病毒可感染免疫缺陷小鼠，出現部分重癥登革熱的臨床癥狀，如出血熱、血管滲漏等，但需進一步驗證免疫反應的產生情況[1-3]。登革病毒可在非人靈長類動物(non-human primates, NHP)體內有效復制，并誘發強烈的免疫反應，但不出現明顯的臨床表現。因此，了解每種登革病毒感染動物模型的優、缺點，揚長避短，努力開展登革熱動物模型研究，才能有效支持登革熱發病機理、抗病毒藥物和疫苗的臨床前評價等研究。本文通過介紹登革病毒感染動物模型的最新進展，闡明其制備方法和研究意義，為今后登革病毒感染疾病的預防與控制研究提供基礎信息。

1 登革熱動物模型研究進展

1.1 小鼠模型

為建立登革病毒感染模型，進行登革熱發病機制研究及防治策略評價，科研人員最初使用登革病毒感染免疫健全小鼠。基于干擾素(IFN)對登革病毒復制的影響，又相繼使用了IFN受體敲除小鼠、I-IFN受體敲除小鼠、條件性I-IFN受體敲除小鼠、及人源化小鼠等。由于動物的免疫系統不盡相同，其臨床表現也不同，具體如下。

1.1.1 免疫健全小鼠模型

研究表明，登革病毒可感染野生型小鼠，即免疫健全小鼠，如A/J、BALB/c、C57BL/6等品系，雖然只出現暫時的病毒復制[2]。有報道指出，DENV-2病毒感染A/J小鼠后第2天，動物出現輕微的病毒血癥，能通過RT-PCR方法檢測出來[4]。DENV-2病毒感染C57BL/6小鼠，外周血液中病毒含量呈峰狀，感染后第1天病毒含量增加，第3天達到高峰，第5天呈下降趨勢。與其他受到感染的動物相比，DENV-2病毒感染BALB/c小鼠后，其血液中病毒滴度相對較低，很難檢測出來[5]。因此，登革病毒在不同品系小鼠內的復制水平不盡相同。此外，小鼠的日齡也會影響登革病毒的感染和復制，登革病毒顱內接種野生型乳鼠，可表現出外周病毒血癥[6]。因此，登革病毒感染免疫健全小鼠只能建立感染模型，無法建立致病模型。

1.1.2 AG129小鼠模型

鑒于干擾素(IFN)在抗病毒中的作用，推測IFN可抑制登革病毒感染。為此，研究者利用缺乏IFNɑ/β、IFNγ受體的AG129小鼠構建了登革病毒感染模型。登革病毒感染AG129小鼠后，病毒復制水平較高，不僅出現病毒血癥、血小板減少和血漿滲漏等典型重癥登革熱的臨床癥狀，還會產生細胞因子風暴引起的免疫病理反應等，因而成為登革病毒感染模型的常用動物。此外，為進一步完善該模型，科研人員還使用登革病毒在小鼠體內進行代及適應，分別建立了DENV1-DENV4感染AG129小鼠模型。如Gregg N. Milligan等建立的DENV-2感染AG129小鼠的致死模型。他使用一種在AG129小鼠體內可產生神經癥狀的DENV-2病毒株PL046，在蚊子細胞和AG129小鼠之間交替傳代，模擬蟲媒病毒的生命周期，產生的新病毒株命名為D2S10。該小鼠模型能很好地模擬登革熱的臨床表現，且不會產生神經癥狀。由于AG129小鼠微弱的固有免疫反應，登革病毒臨床株(如S221和D2Y98P等)也能產生的很好的感染效果。其中以C0360/94(DENV-3病毒株)及703-4(DENV-4毒株)分別感染AG129小鼠，均會產生神經癥狀[7-9]。為明確不同血清型病毒對AG129小鼠的影響，Vanessa V. Sarathy在AG129小鼠及其他小鼠模型中對DENV-4(TVP-376)與DENV-2(D2S10)的易感性進行了比較。發現TVP-376病毒株感染小鼠會導致高病毒載量，然而，與D2S10和C0360/94不同，TVP-376病毒株感染小鼠不會引起血小板減少[10-13]。此后，又有報道描述了DENV-1非適應株(West Pacific 74)感染AG129小鼠模型，采用相同感染方法，可使小鼠致死。然而，West Pacific 74病毒株可使小鼠產生延遲致死性感染，且血管滲漏不明顯，與其他模型具有差異[14]。

1.1.3 I型干擾素受體敲除小鼠

由于I型干擾素(I-IFN)對登革病毒復制產生主要影響，因而科研人員開始使用I型干擾素受體敲除小鼠用于登革病毒感染研究。Susana Orozco等使用105、106或107pfu D2S10及其衍生毒株D220，靜脈接種6～8周齡的IFN-α/β受體敲除的C57BL/6小鼠，并觀察至第14天，發現D220在IFN-α/β受體敲除小鼠中的致死率高于其親代株。在非抗體依賴性增強的條件下，與之前使用D2S10病毒株感染缺乏IFN-α/β和γ受體的AG129小鼠的模型相比，使用低劑量感染免疫受損較低的IFN-α/β受體敲除小鼠，并產生登革熱類似癥狀是一種改進[13]。

1.1.4 條件性敲除I型干擾素受體小鼠

缺乏I型和II型干擾素受體或僅缺乏I型IFN受體的小鼠對登革毒株易感，但感染模型的免疫系統嚴重受損，限制了該模型的廣泛應用。Roland Züst等通過條件性敲除部分免疫細胞的I型IFN受體獲得新的模型——條件性敲除I型干擾素受體小鼠，該小鼠具有免疫保護且對登革病毒敏感。如在CD11c+樹突細胞和LysM+巨噬細胞上敲除IFNAR后，小鼠可被登革病毒感染并致死；而僅在CD11c+或LysM+細胞上敲除IFN受體后，小鼠易受感染，但感染一段時間后小鼠體內的病毒血癥會被消除，從感染中完全恢復。與IFNAR-/-小鼠相比，條件性敲除IFNAR小鼠對登革病毒感染具有快速且強烈的CD8+T細胞反應。此外，在CD11c+或LysM+細胞上缺乏IFNAR的小鼠也具有足夠的免疫活性，對DENV-2亞單位候選疫苗可以產生保護性免疫應答。這些數據表明，在登革病毒免疫研究和疫苗候選物篩選方面，條件性IFNAR表達缺陷的小鼠是一種改進模型[15-16]。

1.1.5 人源化小鼠模型

NOD/SCID等免疫缺陷小鼠缺乏T細胞、B細胞，且NK細胞功能缺陷、抗原呈遞細胞發育和功能缺陷，溶血性補體缺乏，為人類造血細胞和組織的重建提供了良好的平臺[17]。科研人員將登革病毒的靶細胞或其前體細胞注入免疫缺陷小鼠，構建人源化小鼠。該動物具有人的部分細胞，可以使小鼠更好地感染上登革病毒，并引發人類部分針對登革病毒的特異性免疫應答。Jaiswal等[18]表明，使用臍帶血造血干細胞移植的NOD-scidIL2rγnull(NSG)小鼠支持登革病毒感染。來自HLA-A2轉基因NSG小鼠的人T細胞在用登革病毒多肽刺激后可產生IFN-γ和TNF-α。這些小鼠還產生針對登革病毒包膜蛋白的IgM抗體[18]。使用DENV-2臨床株感染人源化NSG小鼠(接種了人臍帶血CD34+細胞)表現出登革熱疾病的臨床癥狀(如發熱、病毒血癥、紅斑和血小板減少癥等)[19]。研究還證明，登革病毒可感染人源化小鼠的骨髓、脾和血液中人的細胞，使其分泌有效的細胞因子和趨化因子[20]。

1.2 非人靈長類動物模型

登革病毒感染的自然宿主是人類和伊蚊。雖然非人靈長類動物感染登革病毒后不會產生典型的臨床癥狀，但也會出現病毒血癥及免疫反應，因此，NHP動物模型可用于研究感染病毒后的免疫反應，或評估候選疫苗[21]。目前，登革研究常用的NHP動物有恒河猴、食蟹猴和新世界猴等[3, 22]。

1.2.1 恒河猴模型(Rhesus macaques)

登革病毒感染恒河猴模型主要用于登革熱疫苗的研發與評價。有研究表明，表達DENV-2的非結構蛋白NS5的登革病毒疫苗，在所有接種的恒河猴體內均誘導產生針對DENV-2的中和抗體，但所產生病毒血癥的情況與預期結果不同，原因尚不清楚。這是在恒河猴模型中首次嘗試使用重組皰疹病毒載體疫苗來預防登革熱，并通過此模型來評價疫苗的免疫反應，在未來的實驗中還可進一步探索新免疫原的效力和廣度[23]。Stefan Fernandez等使用登革病毒感染恒河猴模型，評估了新的TDENV PIV疫苗候選物的免疫原性及其免疫保護作用。結果顯示，具有明礬或佐劑系統的疫苗制劑具有良好的耐受性，在第二次免疫1個月后仍具有對四種血清型登革病毒強烈且持久的中和抗體應答[24]。

1.2.2 狨猴模型

Ananindeua等使用DENV-3感染黑羽狨((Callithrix penicillata)，測定其病毒載量、IgM和IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4等各種細胞因子及血細胞參數，從而進行其外周血標志物的動力學研究。對標志物的網絡分析發現，在登革病毒感染早期，黑羽狨體內有兩條主要路線具有保護作用，分別是：ɑ干擾素/淋巴細胞/血小板，以及病理性的IL-2/IL-6/病毒血癥/單核細胞/凝血酶原(PT bond)[25]。Meng Ling Moi等在普通狨模型(Callithrix jacchus)中評估了二次異型登革病毒感染，先后使用兩種血清型登革病毒感染狨猴，分析其繼發感染后的病毒血癥模式和抗體反應。結果表明：繼發性感染后，狨猴的病毒血癥和抗體反應與人類一致，并表明狨猴模型可用于研究登革病毒的原發性和繼發性感染[26]。

1.2.3 東非狒狒模型(Olive baboon, Papio anubis)

Iris Valde’s等評估了非人靈長類動物東非狒狒(Papio anubis)作為登革熱感染模型的可能性。使用103PFU和104PFU的2型登革病毒(DENV-2)分別感染東非狒狒和非洲綠猴，在兩種動物體內都檢測到較高水平的病毒血癥，以及由中和抗體組成的體液免疫反應。雖然感染該病毒的狒狒體內陽性病毒的檢出通常比非洲綠猴晚一天，但狒狒為DENV-2的實驗性感染提供了另一種非人靈長類動物模型[3]。

2 動物模型的應用

2.1 發病機制中的應用

流行病學研究表明，不同血清型DENV導致的繼發感染，會增加疾病(DF/DHF)的嚴重性[27]。為了解釋這種流行病學觀察，主要有兩個假說：ADE和“T細胞抗原原罪(Original Antigenic Sin, OAS；亦稱原始抗原過失)”。基于T細胞的“抗原原罪”假說表明，繼發性登革病毒感染的增強主要由于非保護性交叉反應性T細胞的存在。有研究通過使用在IFN-α/βR-/-小鼠體內表達人CD8+T細胞表位而建立的的HLA*B0702轉基因小鼠，比較了血清型特異性和交叉反應性T細胞在DENV感染后，對機體的保護與在發病機制中的作用。其結果提示，保護性CD8+T細胞對DENV感染具有保護作用。但交叉反應性T細胞在DHF/DSS發展的晚期可能具有促進發病的作用。這也說明，交叉反應性T細胞在大多數繼發感染病例中是保護性的，但是一些未知因素導致其在DHF/DSS患者中將T細胞的功能從保護性轉變為致病性[28-29]。

通過對登革病毒感染動物模型的研究，使用DENV1-4感染IFNɑ/β、IFNγ受體缺乏的AG129小鼠產生的致死性模型可以用來了解登革熱的發病機制，但該模型的一個缺點是，在使用小鼠適應性毒株時，會產生神經癥狀，且即使在這些干擾素受體敲除小鼠中，大多數登革病毒分離株也不會誘導DHF樣癥狀，只有一部分登革病毒分離株在此背景下提供致死性感染，說明病毒序列在動物模型建立中具有不同的組織嗜性。人源化小鼠模型的應用可使登革病毒體內感染人細胞，并引發人特異性免疫應答反應[30]。使用這些動物模型可以促進對登革熱發病機制的理解與研究[31]。免疫健全小鼠模型表現出對登革病毒感染具有抗性，因為它們的先天免疫系統能夠有效地清除全部病毒，但通過使用小鼠適應性毒株或不同的人工感染途徑，例如顱內或腹腔注射，可增強毒株的致病力，使該模型能用于發病機制的研究及治療藥物和疫苗的測試[6, 32-33]。

2.2 疫苗研究中的應用

雖然非人靈長類動物模型(NHP)不會產生登革熱的典型癥狀，但仍可用于研究病毒感染后的免疫反應以及評估候選疫苗。其中，東非狒狒在遺傳和生理上與人類非常相似，在病毒血癥期間能夠提供足夠的血液來測試評估登革熱疫苗的參數，因而已廣泛用于評價新型疫苗的有效性[3]。目前有研究使用恒河猴模型來評價減毒活疫苗候選物的抗體反應及保護作用，以及候選TDENV PIV疫苗制劑的免疫原性和保護效力，因此可用該模型進行疫苗的臨床前研究[24]。

2.3 抗病毒藥物測試中的應用

Natalia Frias-Staheli等證明，人源化小鼠易受登革病毒臨床分離株感染，產生病毒特異性的適應性免疫應答，并對抗病毒藥物治療有反應。雖然需要對該模型進一步改進，但已證明，人源化BLT小鼠是研究登革病毒感染和發病機制及抗病毒藥物和候選疫苗臨床前測試的合適模型[34]。有研究表明，可使用骨髓細胞亞群Ifnar表達缺失的模型小鼠(LysM Cre+Ifnarf1/f1)篩選新的治療性藥物；該模型出現出包括血管滲漏，血液濃縮，血小板減少和肝損傷等病理表現，可以很好地再現部分人類感染登革病毒后的疾病癥狀，從而為藥物的研發提供理論基礎[35]。

3 討論

隨著登革病毒感染率和發病率不斷上升，登革熱的防治已迫在眉睫。雖然研究者們一直致力于探究登革熱的感染機制，研發抗病毒藥物與預防性疫苗，但一直沒有很好的動物模型能夠完全再現人類感染登革病毒后的臨床癥狀及病理變化。現有登革病毒感染小鼠模型及非人靈長類動物模型表現出部分典型的病毒血癥、抗體反應及臨床與病理表現，可用于登革熱致病機理、疫苗及抗病毒藥物的測試與研究，但這些動物模型仍具有對病毒不敏感、病毒復制水平低、病理表現異化或臨床表型不明確等缺點，還需要繼續深入研究，推動動物模型不斷成熟和完善，從而支撐登革熱致病機制和多價疫苗的研究。