外泌體在腫瘤疾病診斷中的研究進(jìn)展

王 琪， 王保龍

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230000）

外泌體是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小均一、直徑為40～100 nm的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)小囊泡[1]。外泌體的發(fā)現(xiàn)至今已有30多年的歷史，最初是由JOHNSTONE等[2]發(fā)現(xiàn)的羊成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放的一種膜性小囊泡。此后的研究結(jié)果顯示，外泌體可由樹(shù)突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞 、內(nèi)皮細(xì)胞 、成纖維細(xì)胞 、間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等不同類(lèi)型細(xì)胞的脫落釋放，而且其廣泛分布于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、羊水、腹水等[3]。學(xué)者們最初認(rèn)為外泌體發(fā)揮類(lèi)似細(xì)胞垃圾袋的作用，將細(xì)胞不需要的物質(zhì)運(yùn)輸出細(xì)胞。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，外泌體是具有功能活性并可進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞的分泌微囊泡，這種納米級(jí)膜泡中含有受體、生物活性脂類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)和重要遺傳物質(zhì)如mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及片段化DNA等組分，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生、免疫反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程[4]。

近年來(lái)，外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物已逐漸成為研究熱點(diǎn)。外泌體作為細(xì)胞間通訊信息交換的生物載體，在國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤診斷及靶向治療等領(lǐng)域的研究。越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，外泌體與腫瘤有著密不可分的關(guān)系，外泌體參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的很多過(guò)程，包括腫瘤轉(zhuǎn)移及血管新生、抗腫瘤免疫、腫瘤免疫逃逸等[5]。腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)不斷地將外泌體釋放到周?chē)h(huán)境中，在體內(nèi)有較長(zhǎng)的半衰期，且易于從體液中分離，而且外泌體內(nèi)含有腫瘤細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸，因此也可作為生物標(biāo)志物用于腫瘤的輔助診斷、療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后監(jiān)測(cè)等[6]。另外，糖尿病、人類(lèi)免疫缺陷綜合征、慢性炎癥疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病患者細(xì)胞外囊泡水平均升高[7]，因此外泌體也有望成為診斷這類(lèi)疾病的生物標(biāo)志物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

腫瘤是威脅人類(lèi)健康和生存最主要的疾病之一，早期發(fā)現(xiàn)難、治愈率低、預(yù)后差。腫瘤的早期診斷能夠降低患者死亡率。然而，目前臨床上尚缺乏有效的早期診斷方法，亟需尋找可以應(yīng)用于腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物[8]。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的研究者將目光投向了外泌體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床應(yīng)用。外泌體內(nèi)容物繁多且復(fù)雜。目前，ExoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了11 261種蛋白、194種脂類(lèi)、2 375種mRNA和764種miRNA[9]。外泌體在所有類(lèi)型的體液中均可被檢測(cè)到，腫瘤細(xì)胞可以比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體進(jìn)入體液中，且腫瘤外泌體的分子特征能部分反映來(lái)源腫瘤的表型，因此外泌體有成為新的腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力[10]。文章就外泌體在腫瘤診斷應(yīng)用中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 外泌體核酸

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中攜帶的miRNA、mRNA、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及DNA等核酸分子是最受關(guān)注的一類(lèi)可作為腫瘤診斷生物標(biāo)志物的分子。這些分子反映了分泌細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能狀態(tài)，甚至還會(huì)包含細(xì)胞病態(tài)相關(guān)的分子信息，尤其是腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有的miRNA具有異質(zhì)性，這就使得外泌體源性miRNA有可能成為腫瘤診斷的新指標(biāo)[11]。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中的DNA、mRNA及l(fā)ncRNA可反映腫瘤患者的病理生理狀態(tài)及原發(fā)腫瘤的性質(zhì)，有望作為診斷腫瘤的指標(biāo)[12]。

1.1 呼吸系統(tǒng)腫瘤

CAZZOLI等[13]對(duì)肺腺癌患者、肺肉芽腫患者、健康吸煙者的研究結(jié)果顯示，血漿外泌體中的4種miRNA（miRNA-378a、miRNA-379、 miRNA-139-5p和miRNA-200b-5p）可用于肺癌的篩查，另6種miRNA（miRNA-151a-5p、miRNA-30a-3p、miRNA-200b-5p、miRNA-629、miRNA-100和miRNA-154-3p）可用于肺癌的診斷。SILVA等[14]的研究結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）外泌體中的 miRNA 表達(dá)譜與正常組織存在差異，其中l(wèi)et7f 和miRNA-30e-3p的表達(dá)水平可區(qū)分早期和晚期 NSCLC患者，并且二者表達(dá)水平與患者較差的預(yù)后有關(guān)。由此可見(jiàn)，循環(huán)外泌體源性miRNA或可作為肺癌早期診斷的非侵入性生物標(biāo)志物。

1.2 消化系統(tǒng)腫瘤

惡性食管鱗狀細(xì)胞癌患者外泌體miRNA-21顯著高于良性反流性食管炎患者，外泌體miRNA-21的高表達(dá)往往預(yù)示著癌細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)和癌癥復(fù)發(fā)[15]。MADHAVAN等[16]的研究結(jié)果顯示胰腺癌患者外泌體中4種miRNA（miRNA-1246、miRNA-4644、miRNA-3976和miRNA-4306）呈特異性高表達(dá)，而正常對(duì)照者則很少表達(dá)。OGATA-KAWATA等[17]的研究結(jié)果顯示原發(fā)性大腸癌患者有7種miRNA（let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a）的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照者。WANG等[18]的研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）與正常對(duì)照者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示循環(huán)血液中的circRNA對(duì)腫瘤具有重要的診斷價(jià)值。張?jiān)频萚19]的研究結(jié)果顯示，血清外泌體來(lái)源的miRNA-122診斷肝癌的敏感性為81.93%、特異性為82.05%，提示外泌體源性的miRNA-122可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物用于原發(fā)性肝癌的早期診斷。另外，肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶的lncRNA TUC339 明顯升高，也可用于肝癌的診斷[20]。LI等[21]的研究結(jié)果顯示，胃癌患者血液中的lncRNA LINC00152 主要富集在外泌體中，可促進(jìn)胃癌進(jìn)展，也可用于胃癌的診斷。由此可見(jiàn)，外泌體在消化系統(tǒng)腫瘤中具有重要的臨床價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

1.3 泌尿系統(tǒng)腫瘤

BRYANT等[22]通過(guò)分析前列腺癌患者和正常對(duì)照者血液和尿液的外泌體，發(fā)現(xiàn)miRNA-141和miRNA-375或可作為診斷前列腺癌的生物標(biāo)志物。MOTAMEDINIA等[23]的研究結(jié)果顯示尿液中外泌體的mRNA可用于鑒別前列腺癌和良性增生性疾病，尿液中外泌體的基因檢測(cè)可代替病理活檢來(lái)鑒別前列腺癌及單純前列腺特異性抗原升高的疾病。LONG等[24]采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）芯片對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌患者和健康對(duì)照者外泌體中的236種miRNA進(jìn)行分析，其中7種miRNA表達(dá)有差異，這7種miRNA診斷膀胱移行細(xì)胞癌的敏感性和特異性分別為88%和78%，提示miRNA可作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物。

1.4 生殖系統(tǒng)腫瘤

TAYLOR等[25]的研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者與正常人血液中外泌體的miRNA圖譜有明顯差異，卵巢癌患者血清中的外泌體中有8種miRNA表達(dá)顯著升高，提示外泌體有助于卵巢癌的診斷。HANNAFON等[26]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿中外泌體miRNA-1246 和miRNA-21表達(dá)顯著高于健康對(duì)照者（P值分別為0.03、0.04），表明外泌體中的miRNA可用于生殖系統(tǒng)腫瘤的診斷。

1.5 其他腫瘤

在其他系統(tǒng)腫瘤的研究中，MANTEROLA等[27]對(duì)比了惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者及正常對(duì)照者的血清外泌體，利用基因芯片技術(shù)篩選出表達(dá)差異最大的miRNA-574-3P、miRNA-320及RNU6-1，同時(shí)證實(shí)RNU6-1單獨(dú)或多個(gè)miRNA聯(lián)合可特異性地診斷惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。ROCCARO等[28]的研究結(jié)果顯示，miRNA-15a在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體中的表達(dá)明顯下調(diào)，與多發(fā)性骨髓瘤的特性密切相關(guān)。

存在于循環(huán)外泌體中的核酸分子具有作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛力，雖然具體作用機(jī)制還有待深入研究，但其在各種腫瘤的臨床診斷中已表現(xiàn)出巨大的潛力。越來(lái)越多的研究者正致力于在循環(huán)體液中放大這種分子，使其變?yōu)樵\斷工具，從而促進(jìn)腫瘤液體活檢的發(fā)展，為腫瘤的早期診斷打開(kāi)了一扇新的大門(mén)。

2 外泌體蛋白質(zhì)

外泌體中的蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，大體可分為2類(lèi)：一類(lèi)是外泌體中普遍含有，參與其結(jié)構(gòu)形成的蛋白質(zhì)；另一類(lèi)是與細(xì)胞來(lái)源有關(guān)的蛋白質(zhì)，如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中人凋亡相關(guān)因子配體（human factor-related apoptosis ligand，F(xiàn)asL）、腫瘤壞死因子凋亡相關(guān)配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等腫瘤抗原和免疫抑制蛋白[29]，這使得外泌體在腫瘤及相關(guān)疾病的診斷中具有重要的潛在價(jià)值。

2.1 外周血中與腫瘤相關(guān)的外泌體蛋白標(biāo)志物

LI等[30]的研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞高表達(dá)CD97，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。因此，外泌CD97或可作為一種有潛在價(jià)值的胃癌診斷指標(biāo)。與正常人相比，胃癌患者血液外泌體中人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、人趨化因子受體6（human chemokine receptor 6，CCR6）的表達(dá)會(huì)明顯升高[31]。眾多腫瘤的外周血外泌體中多種蛋白存在異常表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 外周血中與腫瘤相關(guān)的外泌體蛋白標(biāo)志物

2.2 尿液中外泌體在腫瘤診斷中的研究進(jìn)展

尿液樣本不僅容易獲得，而且收集簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、數(shù)量大。因此，尿液中外泌體的檢測(cè)對(duì)于泌尿系統(tǒng)腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷等無(wú)疑是個(gè)福音。NILSSON等[37]的研究結(jié)果顯示前列腺癌患者尿液外泌體中可檢測(cè)到跨膜蛋白酶、絲氨酸2-ETS基因、β-連環(huán)蛋白和前列腺癌抗原3等前列腺癌相關(guān)的分子。BECKHAM等[38]通過(guò)抽提尿液外泌體發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者外泌體中表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)折疊1結(jié)構(gòu)域蛋白3抗體（epidermal growth factor-like repeats and discoidin 1-like domains-containing protein 3，EDIL3）水平遠(yuǎn)高于正常人，可作為膀胱癌早期診斷和良好預(yù)后的標(biāo)志物。

3 其他體液中的外泌體在腫瘤診斷中的研究進(jìn)展

除外周血和尿液外，胸水、腹水、唾液、乳汁等體液中的外泌體也具有診斷相應(yīng)組織器官腫瘤的潛力，而且比血液、尿液中的外泌體有更強(qiáng)的器官特異性[39]。YANG等[40]的研究結(jié)果顯示唾液囊泡中的 hCD63 mRNA和GAPDH mRNA 有助于輔助診斷肺癌。WELTON等[41]在研究腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的 miRNA-19a 可靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 ，PTEN）mRNA，從而影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤腦轉(zhuǎn)移。SHIMODA等[42]的研究結(jié)果顯示，組織金屬蛋白酶抑制劑可以減少腫瘤基質(zhì)細(xì)胞釋放促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的外泌體，這類(lèi)細(xì)胞釋放的外泌體可以提高乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。此外，胃癌患者腹水中外泌體表達(dá)的CD63、癌胚抗原、FasL、TraiL等也有作為胃癌生物標(biāo)志物的潛力。除上述體液外，肺泡灌洗液、卵泡液中也發(fā)現(xiàn)了外泌體，在腫瘤、生殖功能、呼吸功能的診斷中有重要價(jià)值[43]。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

外泌體是一類(lèi)攜帶多種有生物學(xué)活性物質(zhì)的膜性囊泡，可作為一種無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的非侵入性疾病診斷手段，在一定條件下能代替組織活檢，以減輕患者的痛苦，提高疾病早期診斷率。腫瘤源性外泌體作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的早期診斷、疾病監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估中有著較好的應(yīng)用前景。另外，外泌體在心血管疾病、感染性疾病等非腫瘤疾病中的應(yīng)用也頗受關(guān)注。目前，外泌體中作為疾病診斷生物標(biāo)志物的物質(zhì)主要是核酸和蛋白質(zhì)，在后續(xù)研究中脂質(zhì)等也有望成為疾病診斷的生物標(biāo)志物。然而，外泌體的分離技術(shù)目前還不夠完善，難以得到純度較高的外泌體，對(duì)后續(xù)的檢測(cè)和分析造成了一定的困難；而且外泌體的檢測(cè)系統(tǒng)也尚未成熟，難以滿足臨床大樣本量的檢測(cè)。因此，如何在各種體液中檢測(cè)到疾病特異性的外泌體生物標(biāo)志物將是今后努力探索的目標(biāo)之一。總之，外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物仍處于早期研究階段，要應(yīng)用于臨床診斷還有很長(zhǎng)的一段路要走。

外泌體除了有作為生物標(biāo)志物的巨大潛力外，還為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供了新的研究方向。目前，外泌體的應(yīng)用開(kāi)始進(jìn)入不同的臨床試驗(yàn)階段，一些基于外泌體的臨床研究方案也已逐步建立。在非小細(xì)胞肺癌患者負(fù)載自體樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體的接種試驗(yàn)中，有9例患者已完成疫苗治療；基于樹(shù)突狀細(xì)胞釋放的外泌體治療晚期腫瘤患者的方案安全可行[44]。外泌體在疾病診斷和治療中的應(yīng)用前景廣闊，但如何實(shí)現(xiàn)其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值仍需研究者們的共同努力。