高糖環境下不同濃度黃芪注射液對腎小管上皮細胞凋亡及NF-κB表達的影響

梅莎莎，宋恩峰，項 瓊

(武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發癥，其病因及發病機制尚不清楚，最終會發展為終末期腎衰竭[1-2]。腎小管上皮細胞的損傷在糖尿病腎病發病早期就已經存在，可表現為結構和功能的損傷，如腎小管細胞各種炎癥反應以及腎小管上皮細胞的凋亡[3]。腎小管上皮細胞的過度凋亡可導致腎小管損傷，加速腎功能衰竭。而高血糖作為獨立危險因素可促進腎小管上皮細胞凋亡，激活核轉錄因子-κB(NF-κB)，NF-κB作為炎癥介質，可激活腎臟內的一系列炎癥反應，加重腎臟損害，加速糖尿病腎病的發生發展[4-5]。中藥黃芪具有保護腎功能及降低血糖作用[6-7]，且筆者前期試驗發現黃芪注射液能夠抑制腎小管上皮細胞的過度凋亡及NF-κB的表達，對DN有保護作用[8-9]。本實驗旨在探討黃芪注射液濃度與細胞凋亡率、NF-κB蛋白表達間的關系，為臨床治療DN提供依據。

1 實驗資料

1.1材料 人近曲腎小管上皮細胞株(HK-2)，武漢大學人民醫院腎內科實驗室惠贈；黃芪注射液，哈爾濱圣泰制藥股份有限公司，國藥準字Z23020820；DMEM高糖培養基、DMEM低糖培養基、0.25%胰酶溶液、青-鏈霉素溶液、PBS，吉諾生物醫藥技術有限公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；DMSO，sigma公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒，Clontech 公司；流式細胞儀，Becton Dickinson 公司：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天；PVDF膜，Millipore；GAPDH抗體，杭州賢至生物有限公司；NF-κBp65，Bioworlde；HRP標記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；ECL底物液，Thermo；顯影定影試劑盒，武漢巴菲爾生物。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人近曲腎小管上皮細胞生長于濃度為10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM低糖完全培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。顯微鏡觀察細胞生長情況，2～3 d可進行傳代，傳代比例為1∶3，試驗用第6代細胞。

1.2.2實驗分組與處理 待細胞融合至80%，將培養基換成無血清DMEM低糖培養基同步化24 h后，棄去無血清培養基。將細胞分為低糖組(低糖培養基含D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖組(高糖培養基含D-葡萄糖25 mmol/L)、高糖+2 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養基+2 μg/mL黃芪注射液)、高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養基+20 μg/mL黃芪注射液)、高糖+200 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養基+200 μg/mL黃芪注射液)，每組設3個復孔。于37 ℃培養箱中培養48 h、72 h(前期試驗[8]表明培養48 h、72 h能明顯降低凋亡率及NF-κB的表達)，收集細胞及細胞上清液用于后續試驗。

1.2.3細胞凋亡率檢測 每組設3個復孔，培養48 h、72 h后胰酶消化進行細胞收集，用250 μL結合緩沖液調節細胞濃度為1×105mL-1，在重懸液中依次加入5 μL Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL Propidium Iodide(PI)，混勻后避光在冰上孵育15 min。再加入400 μL 結合緩沖液后混勻，上流式細胞儀進行定量分析，每組測3次。

1.2.4NF-κB蛋白表達檢測 每組設3個復孔，培養48 h、72 h后胰酶消化進行細胞收集。采用Western blot法測定。配制裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品進行凝膠電泳。電泳結束后將凝膠移入轉膜緩沖液固定，轉膜完畢后將膜置人含5%(W/V) 脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中，室溫下封閉1 h。加入一抗，搖床4 ℃反應過夜，用PBST洗滌3次后用封閉液稀釋熒光二抗，室溫下反應 30 min，用PBST洗滌后加ECL底物液，孵育數分鐘。等熒光條帶顯示清楚后，將多余的底物液用濾紙吸出，待X膠片壓片好后進行顯影和定影。

2 結 果

2.1各組培養不同時間腎小管上皮細胞凋亡率比較 培養48 h和72 h，高糖組細胞凋亡率均明顯高于低糖組(P均<0.05)；黃芪注射液各干預組細胞凋亡率均明顯低于高糖組(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組和高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)，高糖+20 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)。見表1及圖1。

2.2各組培養不同時間NF-κB蛋白表達量比較培養48 h和72 h，高糖組NF-κB蛋白表達量均明顯高于低糖組(P均<0.05)；黃芪注射液各干預組NF-κB蛋白表達量均明顯低于高糖組(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組和高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)。見表2及圖2和圖3。

表1 各組培養不同時間腎小管上皮細胞凋亡率比較

注：①與高糖組比較，P<0.05；②與高糖+200 μg/mL黃芪注射液組 比較，P<0.05；③與高糖+20 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05。

2.3高糖環境下黃芪注射液濃度、細胞凋亡率、NF-κB蛋白表達之間的相關性 細胞培養48 h、72 h，黃芪注射液濃度與細胞凋亡率呈負相關(r=-0.856,-0.889,P均<0.05),與NF-κB蛋白表達量也呈負相關(r=-0.669,-0.704,P均<0.05)；NF-κB蛋白表達量與細胞凋亡率呈正相關(r=0.828,0.765,P均<0.05)。

3 討 論

我國糖尿病患者已經超過9 000萬人，約有1/3的患者會并發DN，正威脅著人們的健康[10]。DN在中醫歸屬“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血、痰濕為標，治則應補氣利水，活血化瘀。本實驗通過觀察黃芪注射液對腎小管上皮細胞凋亡和NF-κB蛋白表達的影響及分析三者的關系，探討了黃芪注射液治療DN的機制。

注：A為低糖組，B為高糖組，C為高糖+2 μg/mL黃芪注射液組，D為高糖+20 μg/mL黃芪注射液組，E為高糖+200 μg/mL黃芪注射液組

圖1 各組培養48 h和72 h腎小管上皮細胞凋亡情況

表2 各組培養不同時間NF-κB蛋白表達量比較

注：①與高糖組比較，P<0.05；②與高糖+200 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05；③與高糖+20 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05。

圖2 各組培養48 h NF-κB蛋白表達情況

圖3 各組培養72 h NF-κB蛋白表達情況

在DN的發展過程中，高血糖有重要的促進作用，長期的高血糖可導致腎組織和功能損害，從而加速腎衰竭的進展。研究表明NF-κB主要以無活性形式表達于腎小管上皮細胞，但腎小管上皮細胞在高糖培養基中培養后發現NF-κB表達明顯增加且活性增強[11]。此外，高血糖還可通過多途徑誘導腎小管上皮細胞的凋亡[12-13]。本實驗結果也表明高糖環境可促進NF-κB蛋白表達及腎小管上皮細胞凋亡。

NF-κB參與機體的各種應激、炎癥反應，其與細胞凋亡有密切關系，參與多種細胞的凋亡相關基因的轉錄調控，對細胞凋亡有雙向調節作用。在某些因素的刺激及特定的細胞中，NF-κB的活化有促進細胞凋亡的作用，該作用可能是通過抑制抗凋亡基因實現的。腎小管上皮細胞中NF-κB表達的增加與細胞凋亡是否有聯系尚不明確，本實驗相關性結果表明兩者存在正相關，即NF-κB表達的增加可能使腎小管上皮細胞凋亡率增加，細胞凋亡發生機制可能與NF-κB相關。

黃芪注射液的主要成分是黃芪甲甙，有益氣養元、扶正祛邪、養心通脈、健脾利濕等作用，其聯合其他藥物治療DN療效顯著[14]。本實驗結果顯示，細胞培養48h和72h，高糖組細胞凋亡率及NF-κB蛋白表達量均明顯高于其他組，黃芪注射液能顯著減少腎小管上皮細胞凋亡及NF-κB蛋白表達；黃芪注射液濃度與NF-κB蛋白表達及細胞凋亡率呈負相關，細胞凋亡率與NF-κB蛋白表達呈正相關。推測高糖可誘導腎小管上皮細胞中NF-κB蛋白表達增加，而NF-κB能夠促進細胞凋亡，使細胞凋亡率增加，黃芪注射液可通過抑制NF-κB蛋白表達，降低細胞凋亡率，對腎小管上皮細胞起到保護作用。但黃芪注射液作為中藥提取物，對DN發病機制的作用為多靶點，其具體作用機制仍不清楚，還有待進一步研究。