醒腦靜注射液對急性腦梗死血瘀證患者外周血單個核細胞T-bet/GATA-3平衡的影響

張 帆,張晨紅

(陜西省核工業215醫院,陜西 咸陽 712000)

急性腦梗死也稱作缺血性腦卒中，是由于腦部血管動脈粥樣硬化而導致的血管狹窄以及閉塞，繼而出現腦組織缺氧以及缺血性壞死引發的神經系統疾病，臨床以血瘀證為主要證型。急性腦梗死的發病過程與炎性反應、自由基增加、鈣水平異常升高、細胞凋亡等因素密切相關，而T-bet與GATA-3免疫平衡與該病的關系尚不十分明確[1]。有研究證實，醒腦靜注射液用于急性腦梗死的治療效果較好[2]。故本研究觀察了醒腦靜注射液對血瘀證急性腦梗死患者外周單個核細胞(PBMC)中T-bet與GATA-3表達情況的影響，期望能夠為急性腦梗死的治療更多參考依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇我院2015年9月—2016年12月收治的急性腦梗死患者80例，均符合《全國第四屆腦血管病學術會議紀要》[3]中制定的臨床診斷標準，均參照《血瘀證中西醫結合診療共識》[4]判定為血瘀證，患者均在發病24 h內住院治療，在發病48 h內意識較為清晰或者存在輕度障礙。排除肝、腎、肺、心存在功能性問題者，合并心肌梗死、糖尿病、心律失常者，合并慢性感染性疾病、腦部腫瘤、免疫風濕性疾病者，CT或者MRI診斷為腦出血與蛛網膜下腔出血者。本次臨床研究上報醫學倫理委員會獲得批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。隨機將80例入選者分為2組：觀察組40例，男24例，女16例；年齡45～80(60.73±5.81)歲；發病至入院時間(16.49±5.24)h；存在吸煙史者16例，高血壓病史者17例。對照組40例，男22例，女18例；年齡44～82(60.59±5.66)歲；發病至入院時間(16.54±5.33)h；存在吸煙史者17例，高血壓病史者18例。2組患者的性別比、年齡、發病時間等資料比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，均衡性較好。

1.2治療方法 對照組患者在入組后給予抗凝、保護腦神經等常規治療，其中阿司匹林片(昆明制藥集團金泰得藥業股份有限公司，國藥準字H53021985，規格：0.5 g/片)每晚0.3 g口服，持續服藥1周后改為每次0.1 g，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051407，規格：10 mg/片)每晚40 mg。觀察組患者入組后在常規治療基礎上給予醒腦靜注射液(大理藥業股份有限公司，國藥準字Z53021636，規格：10 mL/支)30 mL加入0.9%氯化鈉注射液250 mL中靜脈滴注。2組均持續治療2周為1個療程。

1.3觀察指標 ①PBMC中T-bet與GATA-3表達情況：分別于治療前后抽取2組患者的清晨空腹外周靜脈血15 mL，在肝素抗凝處理后，以Ficoll密度梯度離心方法提取外周血中的淋巴細胞，分離PMBC，在1640培養液中洗滌2次后重懸制備PBMC。采用RT-PCR法測定PBMC中T-bet mRNA與GATA-3 mRNA表達情況：選擇Trizol試劑提取總RNA，采用AMV逆轉錄酶法合成cDNA，將3μg總RNA加入RT反應體系試管中，RT反應體系包含1 μL的M-MLV、1μL的RNasin、1μL的Random Primers、5 μL的5×MMV Buffer、2.5 μL的4×dNTPs，在試管中以DEPC水補充容量，最終反應液體積為25 μL，在混合均勻后離心處理。在43 ℃的環境下靜置30 min，在99 ℃的條件下靜置5 min后，保存在-40 ℃的環境中。選擇PCR擴增儀測定PBMC中T-bet mRNA與GATA-3 mRNA表達水平，內部參考選擇β-actin。引物序列中T-bet的上游引物為5’-CCGTGACTGCCTACCAGAAT-3’，下游引物為5’-TCATGCTGACTGCGCGAAAC-3’，擴增產物長度為312 dp。GATA-3的上游引物為5’-AGGCAGGGAGTGTGTGAACT-3’，下游引物為5’-TTTTTCGGTTTCTGGTVTGG-3’，擴增產物長度為326 bp。β-actin上游引物為5’-GTGGGCCGCCGACACCA-3’，下游引物為5’-CGGTTGGCCTTGGGATTGAG-3’，擴增產物長度為247 bp。反應體系選擇為25 μL，在94 ℃預變性處理2 min，30 s 94 ℃、50 s 60 ℃、1 min 72 ℃循環，持續25個循環，在73 ℃中延伸處理3 min。在濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠中加入10 μL的擴增產物，在100 V的電泳環境下處理20 min,采用圖像分析軟件分析各條帶的平均灰度值，以擴增的β-actin為內參照，計算各指標的相對表達量。②生活質量：分別于治療前及治療第3，5，7天以改良Barthel指數(MBI)評分[5]評價2組患者生活質量。③統計2組治療過程中不良反應發生情況。

1.4統計學方法 采用SPSS 15.0軟件包進行數據處理。計數資料比較采用2檢驗；計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組治療前后血清T-betmRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3表達情況比較 2組治療前T-betmRNA、GATA-3 mRNA與T-bet/GATA-3表達情況比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。治療1個療程后，2組T-betmRNA、T-bet/GATA-3表達水平均明顯降低(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表達水平均明顯升高(P均<0.05)；觀察組治療后T-bet mRNA、T-bet/GATA-3表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.22組治療前后MBI評分比較 2組治療前MBI評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，2組治療3 d、7 d、14 d后MBI評分均明顯高于治療前(P均<0.05)，且觀察組明顯高于對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 2組治療前后PBMC中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA與T-bet/GATA-3表達情況比較

表2 2組治療前后MBI評分比較分)

注：①與治療前比較，P<0.05。

2.32組治療過程中不良反應發生情況比較 對照組患者治療中出現頭痛2例，心悸1例，不良反應發生率為7.5%；觀察組患者治療中出現頭痛1例，皮膚過敏1例，不良反應發生率為5.0%。2組不良反應發生率比較差異無統計學意義(2=0.709,P>0.05)。

3 討 論

急性腦梗死屬于中醫 “中風”范疇，早在《黃帝內經》中就有相似疾病名稱的論述。主要的致病機制是血氣逆亂，瘀血阻滯，所以血瘀證是急性腦梗死的主要中醫證型。醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎上改進的水溶性中藥注射制劑，主要成分為梔子、麝香、冰片、郁金等。其中麝香氣味芬芳，具有良好的通痹開竅功效，是回蘇醒神的主要藥物[6]。而冰片性微寒而味辛苦，能夠疏散郁火而通諸竅，與麝香配合能夠有效開竅醒神[7]。梔子則能夠通瀉三焦之火，具有解毒利濕、涼血清熱的功效[8]。郁金能夠止痛祛瘀活血、解郁涼血、行氣清心[9]。多種藥物聯合作用，可以有效發揮活血祛痰、開竅醒神、解毒清熱的功效。本研究中，觀察組應用醒腦靜注射液治療2周后，患者的生存質量MBI評分明顯高于治療前及同期對照組，表明聯合醒腦靜注射液治療相比單純西藥治療可以有效改善患者生存質量，對疾病康復有積極作用。

急性腦梗死患者發病后的炎性癥狀以及免疫系統反應導致的機體炎性因子水平升高，是腦梗死區域以及缺血性半暗帶區域的神經元損傷主要原因[10]。而其中T細胞免疫功能紊亂是急性腦梗死發病中的重要因素[11]，Th1與Th2細胞因子的平衡失調與急性腦梗死的發病以及進展有著密切關系[12]。Th1與Th2細胞亞群都是通過Th0前體細胞分化產生的，T-bet與GATA-3是Th1與Th2細胞分化的主要調節因子，在Th1與Th2細胞中表達呈現出特異性，二者是細胞分化過程中具有相反方向調控作用的因子[13-14]。T-bet與GATA-3能夠決定Th前體細胞是分化成為Th1或者是Th2細胞，所以說轉錄因子T-bet與GATA-3是確定Th0細胞分化方向的具體指標，而T-bet/GATA-3比值能夠反映Th1/Th2的分化情況，相比單一的因子表達更加客觀，能夠確定Th1與Th2的免疫平衡狀態。T-bet與GATA-3還可以與不同炎癥因子相結合，構成相互調節的環狀通路，實現動態調節的功能。近年來的研究中發現，通過有效的干預方法可以調節T-bet/GATA-3的信號傳導通路，進而改變二者的活性水平，完成Th1與Th2平衡的調節[15]。本研究中，治療后觀察組PMBC中T-bet mRNA表達水平明顯降低，而GATA-3 mRNA表達水平明顯升高，T-bet/GATA-3比值明顯降低。表明醒腦靜注射液可以在細胞分化的最初過程發揮作用，可以有效抑制Th1的免疫反應，調節Th1/Th2失衡的免疫反應逐漸向Th2傾斜，緩解免疫系統功能失衡狀態。

綜上所述，醒腦靜注射液輔助治療血瘀證急性腦梗死，可發揮T-bet/GATA-3的雙向調節作用，從而恢復Th1與Th2細胞亞群的免疫平衡，改善患者生存質量，安全性也較好。但是醒腦靜注射液對患者T-bet/GATA-3平衡調節的具體機制還沒有完全明確，需要更多的研究支持。