黃花石蓮總黃酮超聲輔助提取及抗氧化活性研究*

李瑤佳 王 君 毛 攀 伍仕杰 江文世*

（西昌學院農業科學學院，四川西昌 615000）

黃花石蓮 （Sinocrassulaindica var.Luteorubra）屬于石蓮的一個變種，是景天科（crassulaceae）多年生無毛草本植物。在我國，黃花石蓮主要生長在云南貢山地區海拔3 300 m～3 700 m的巖石隙中以及四川西南山區。黃花石蓮中含有黃酮（flavonoids）、黃菲素（flavidin）、D-葡萄糖（D-glucose）、鼠李糖（rhamnose）、L-阿拉伯糖（L-arabinose）等種類繁多的化合物。其葉片可煮湯食用，也可入藥使用，具有滋陰益氣、散瘀消腫、控制血糖等功效。黃酮類化合物是一類具有苯環和羥基結構化合物的總稱，具有止咳、抑菌、消炎、抗氧化、預防心腦血管疾病等方面的作用。黃酮類物質易溶于丙酮、水、乙酸乙酯、乙醇等極性較大的溶劑中。植物中的總黃酮通常采用乙醇或丙酮提取。本文以黃花石蓮的葉為原料，采用超聲輔助提取黃花石蓮中總黃酮，研究乙醇、丙酮和丙酮-乙醇作為提取溶劑對黃花石蓮總黃酮的提取率，并通過正交試驗對提取工藝條件進行優化。同時，以抗壞血酸作為陽性對照，測定不同質量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液對1，1-苯基-2-苦肼基（DPPH·）自由基、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，評價其抗氧化活性，旨在為更好地開發利用黃花石蓮中黃酮類化合物提供數據支撐。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

黃花石蓮采自四川省西昌市禮州鎮；焦性沒食子酸、水楊酸、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、過氧化氫、鹽酸、冰乙酸、甲醇、無水乙醇、丙酮，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；無水三氯化鋁，分析純，天津市大茂化學試劑廠；蘆丁標準品，合肥博美科技生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），分析純，上海瑞永生物科技有限公司；乙酸鉀、抗壞血酸，分析純，天津市光復化工研究所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 試驗儀器與設備

UV 5800PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；KH-250SPV雙頻數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；HR-04多功能粉碎機，上海哈瑞斯電器有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵，鞏義市英峪華科儀器廠；DHG-9140B智能型電熱鼓風干燥箱，上海成順儀器儀表有限公司；RE-201D旋轉蒸發儀，河南蘭帆科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃花石蓮樣品制備

黃花石蓮葉→挑選→自來水洗→超純水洗→烘箱干燥→粉碎→過篩→樣品。

1.3.2 標準曲線繪制

總黃酮含量測定參照標準NY/T1295-2007的方法。分別吸取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL蘆丁標準溶液于10 mL比色管中，加入1 mL 0.1 mol/L的AlCl3溶液和1 mL 1 mol/L的乙酸鉀溶液，用體積濃度70%的甲醇定容至刻度，得到蘆丁質量濃度分別為 0 mg/mL、0.021 mg/mL、0.042 mg/mL、0.063 mg/mL、0.084 mg/mL的溶液，靜置30 min，用分光光度計在419 nm處測定溶液的吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖1。線性回歸方程為：y=29.61x+0.052；R2=0.999。

圖1 蘆丁標準曲線

1.3.3 不同溶劑對黃花石蓮總黃酮的提取

準確稱取1.000 g黃花石蓮樣品于錐形瓶中，用不同的溶劑（乙醇、丙酮、丙酮-乙醇）提取，提取溶液體積濃度為75%、超聲溫度為50℃、超聲時間30 min、料液比為1 g∶30 mL，重復3次，隨帶試劑空白。

1.3.4 丙酮-乙醇對黃花石蓮中總黃酮的提取

準確稱取1.000 g黃花石蓮樣品于錐形瓶中，加入一定體積比、體積濃度的丙酮-乙醇混合提取液，在一定時間和溫度條件下進行超聲提取，減壓抽濾，收集濾液后旋轉蒸發濃縮，用丙酮-乙醇混合溶液定容至50 mL，重復3次，隨帶試劑空白。總黃酮提取率按下列公式計算：

式中：C——待測溶液的吸光度值帶入回歸方程計算得到的總黃酮的質量濃度，mg/mL；

V——待測溶液的體積，mL；

D——溶液的稀釋倍數；

m——樣品的質量，g。

1.3.5 單因素試驗設計

分別考察超聲時間、超聲溫度、料液比、丙酮-乙醇體積比、混合提取溶液體積濃度對黃花石蓮總黃酮提取率的影響。①超聲時間采用20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的條件進行單因素試驗，超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液濃度為75%；②超聲溫度采用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件進行單因素試驗，超聲時間為30 min、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液體積濃度為75%；③料液比采用1 g∶30 mL、1 g∶35 mL、1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL的條件進行單因素試驗，超聲時間為30 min、超聲溫度為50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液體積濃度為75%；④丙酮-乙醇體積比采用 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的條件進行單因素試驗，超聲時間為30 min、超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、混合提取溶液體積濃度為75%；⑤混合提取溶液體積濃度采用75%、80%、85%、90%、95%的條件進行單因素試驗，超聲時間為30 min、超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3。

1.3.6 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取超聲溫度、料液比、丙酮-乙醇配比、混合溶液濃度，做L9（34）正交試驗，優化提取條件，正交試驗設計表見表1，并采用方差分析來研究4個因素對黃花石蓮總黃酮提取率影響的顯著性水平。

表1 正交優化試驗因素水平表

1.3.7 黃花石蓮總黃酮抗氧化活性測定

將超聲輔助提取得到的總黃酮提取液分別配置 為 0.059 mg/mL、 0.118 mg/mL、 0.177 mg/mL、0.236 mg/mL、0.295 mg/mL和0.354 mg/mL 6個不同質量濃度，研究其抗氧化能力。

參照文獻的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除DPPH·的能力。取6支10 mL比色管加入1 mL不同質量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液，再分別加入2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混合反應30 min，在波長517 nm處用分光光度計測定吸光度值，記為Di；超純水代替樣品溶液測定的吸光度值，記為Dc；無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液測定的吸光度值，記為Db，以抗壞血酸作為陽性對照。黃花石蓮中總黃酮對DPPH·清除率計算公式為：

1.3.7.2 黃花石蓮中總黃酮清除·OH的測定

參照文獻的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除·OH的能力。取6支10 mL比色管，加入1 mL不同質量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液，再分別加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液各2 mL，用超純水定容至刻度，37℃水浴反應30 min，在波長510 nm處用分光光度計測定吸光度值，記為DX，超純水代替H2O2溶液測定的吸光度值，記為DX0，超純水代替樣品溶液測定的吸光度值，記為D0，同時，以抗壞血酸作為陽性對照。黃花石蓮總黃酮對·OH清除率計算公式為：

1.3.7.3 黃花石蓮總黃酮清除O2-·的測定

參照文獻的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除O2-·的能力。取6支10 mL比色管分別加入1 mL不同質量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液、4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH=8.2）混勻，于 25 ℃恒溫水浴反應20 min，取出后加入25℃預熱好的鄰苯三酚溶液（3 mmol/L）0.3 mL，以 0.3 mL鹽酸（10 mmol/L）代替作參比，混勻后迅速在波長為325 nm處測定吸光度，每隔30 s測定一次，總共測定5 min。計算黃花石蓮總黃酮溶液的吸光度隨時間的變化率，記為Fx；用超純水代替樣品溶液，按同樣方法測定吸光度，計算空白液的吸光度隨時間的變化率，記為F0。黃花石蓮總黃酮對O2-·清除率計算公式為：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同提取溶劑對提取率的影響

試驗結果見表2。由表2可知，不同提取溶劑對總黃酮的提取率從大到小依次為丙酮-乙醇＞乙醇＞丙酮，提取率分別為1.207%、1.195%和1.250%。因此，選擇丙酮-乙醇混合溶液作為提取溶劑，來進行下一步總黃酮提取率的研究。

表2 不同提取溶劑對總黃酮提取率的比較（x±s，n=3）

2.1.2 超聲時間對提取率的影響

農業生產中防災減災工作對氣象的依賴程度越高，對農業氣象工作者服務準確度的要求就會越高。因此，應結合我國實際來完善我國的氣象預報系統，而且基層氣象部門要對農業氣象工作起到推進作用。

試驗結果見圖2。

圖2 超聲時間對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，超聲時間在20 min～60 min范圍內，黃花石蓮中總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，在50 min時，得到最高提取率為1.255%。結果表明，超聲時間對黃花石蓮總黃酮提取率有一定影響。超聲時間太短，提取液不能充分滲透進植物細胞中將黃酮類化合物提取出來，提取率較低；超聲時間太長，黃酮類化合物穩定性降低以及一些非黃酮類物質溶出增加，與黃酮類化合物的溶解形成競爭性抑制，導致提取率降低。因此，選擇最佳超聲時間為50 min。

2.1.3 超聲溫度對提取率的影響

試驗結果見圖3。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲溫度在30℃～70℃范圍內，總黃酮提取率隨溫度的升高而增加，在50℃時，得到最高提取率為1.232%，繼續升高溫度，總黃酮提取率逐漸下降。這是因為隨著溫度升高，分子間的運動速度加快，黃酮類化合物在提取液中的溶解度逐漸增加，提取率增加。繼續升高溫度，總黃酮提取率降低，這是由于溫度太高，黃酮類化合物結構被破壞，乙醇和丙酮揮發，提取液濃度降低，導致總黃酮提取率下降。因此，選擇40℃、50℃、60℃三個水平進行下一步正交試驗。

2.1.4 料液比對提取率的影響

試驗結果見圖4。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，料液比在1g∶30mL～1 g∶50 mL范圍內，總黃酮提取率隨著料液比增大而增加，當料液比達到1 g∶40 mL時，繼續增加料液比，總黃酮提取率趨于穩定，料液比為1 g∶50 mL時總黃酮提取率最大（1.258%）。料液比較低時，總黃酮不能充分溶解，增加料液比時可以提高總黃酮的溶出率；當料液比過大時，提取液中的總黃酮濃度降低，導致植物細胞內外濃度差下降，滲透壓降低，影響總黃酮的溶出。而且料液比太大，后續溶劑蒸發和濃縮負荷太大，在保證提取效率的同時，應盡量減少溶劑用量。因此，選擇1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL三個水平進行下一步正交試驗。

2.1.5 丙酮-乙醇體積比對提取率的影響

試驗結果見下頁圖5。

圖5 丙酮-乙醇配比對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，丙酮-乙醇體積比在1:1～1:5范圍內，總黃酮提取率隨著混合提取液中乙醇比例的增加而增加，在體積比1∶4時，總黃酮提取率達到最高（1.324%），隨后隨著混合提取液中乙醇比例的增加而降低。這是由于當混合提取液中乙醇比例的增加，總黃酮中溶于乙醇和丙酮的化合物被提取出來，提取率升高，但是當乙醇比例增加到一定程度時，提取液中醇溶性物質達到飽和，且由于混合提取液中丙酮的比例降低，黃酮類化合物中能溶于丙酮的一些化合物也不能全部溶解，導致提取率降低。因此，選擇1∶3、1∶4、1∶5三個水平進行下一步正交試驗。

2.1.6 丙酮-乙醇混合溶液體積濃度對提取率的影響

試驗結果見圖6。

圖6 混合溶液濃度對總黃酮提取率的影響

由圖6可知，丙酮-乙醇混合溶液體積濃度在75%～95%范圍內，總黃酮提取率隨著混合溶液濃度的增加而增加，當混合溶液體積濃度為85%時，總黃酮提取率最大（1.384%），隨著混合溶液體積濃度的繼續增加，總黃酮提取率降低。這是由于混合溶液體積濃度增大，溶于丙酮-乙醇中的黃酮類化合物增加，提取率增加，當混合溶液濃度增加到一定程度時，黃酮中溶于水的部分，溶出量降低，并且隨著混合溶液體積濃度繼續增加，一些脂溶性物質會被提取出來，與黃酮類化合物的溶解形成競爭，導致總黃酮提取率下降。因此，選擇混合溶液體積濃度為80%、85%、90%三個水平進行下一步正交試驗。

2.2 正交試驗結果

由正交試驗結果表3和方差分析結果表4可知，4種因素對黃花石蓮總黃酮提取率的影響由大到小為：混合提取液體積濃度＞超聲溫度＞丙酮-乙醇體積比＞料液比。其中超聲溫度、混合提取液體積濃度和丙酮-乙醇體積比對總黃酮提取率的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），料液比對總黃酮提取率的影響不顯著（P＞0.05）。通過極差分析和方差分析可以得出黃花石蓮中總黃酮提取的優化工藝組合為A2B2C2D2，即：超聲時間50 min、超聲溫度50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶4、丙酮-乙醇混合溶液體積濃度為85%、料液比1 g∶45 mL。在此工藝條件下進行驗證試驗，重復6次，黃花石蓮總黃酮的平均提取率為1.677%，RSD為1.17%，大于正交試驗表3中的最高提取率1.509%，為最終優化的黃花石蓮總黃酮提取條件。

表4 正交試驗方差分析表

2.4 黃花石蓮總黃酮的抗氧化活性

2.4.1 黃花石蓮總黃酮對DPPH·的清除能力

試驗結果見圖7。

圖7 黃花石蓮總黃酮對DPPH·的清除率

由圖7可知，質量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對DPPH·的清除能力隨著質量濃度增大而增大。當總黃酮質量濃度為0.354 mg/mL時，DPPH·的清除率達到最大，為94.92%。與相同質量濃度的抗壞血酸相比，當質量濃度低于0.118 mg/mL時，對DPPH·的清除率低于抗壞血酸；當質量濃度高于0.118 mg/mL時，對DPPH·的清除率高于抗壞血酸。黃花石蓮總黃酮對DPPH·最大清除率比抗壞血酸對DPPH·的最大清除率高3.18%。結果表明黃花石蓮總黃酮具有較強的清除DPPH·的能力。

表3 正交試驗結果（x±s，n=3）

2.4.2 黃花石蓮總黃酮對·OH的清除能力

試驗結果見圖8。

圖8 黃花石蓮總黃酮對·OH的清除率

由圖8可知，質量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對·OH的清除能力隨著質量濃度增大而增大。當總黃酮質量濃度為0.354 mg/mL時，對·OH的清除率達到最大，為23.96%。與相同質量濃度的抗壞血酸相比，黃花石蓮總黃酮對·OH的清除率均低于抗壞血酸，但也表現出一定的清除·OH能力。

2.4.3 黃花石蓮總黃酮對O2-·的清除能力

試驗結果見圖9。

圖9 黃花石蓮總黃酮對O2-·的清除率

由圖9可知，質量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對O2-·的清除能力隨著質量濃度增大而增大。當總黃酮質量濃度為 0.354 mg/mL時，對O2-·的清除率最大，為18.91%。與相同質量濃度的抗壞血酸相比，黃花石蓮總黃酮對O2-·的最清除率均低于抗壞血酸，但也表現出一定的清除O2-·能力。

3 結論

丙酮-乙醇混合溶液作為提取劑對黃花石蓮總黃酮的提取率高于乙醇，而丙酮最低。通過單因素試驗和正交試驗，得出影響黃花石蓮總黃酮提取率因素的大小為，混合提取液體積濃度＞超聲溫度＞丙酮-乙醇體積比＞料液比。其中超聲溫度、混合提取液體積濃度和丙酮-乙醇體積比對總黃酮提取率的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），料液比對總黃酮提取率的影響不顯著（P＞0.05）。提取工藝條件為：超聲時間50 min、超聲溫度50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶4、丙酮-乙醇混合溶液體積濃度為85%，料液比1 g∶45mL。在優化工藝條件下進行驗證試驗，重復6次，得到黃花石蓮總黃酮的平均提取率為1.677%，RSD為1.17%。質量濃度在0.059 mg/mL～0.354 mg/mL范圍內，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對DPPH·、·OH、和O2-·的清除能力，隨著質量濃度的增加而增加，當黃花石蓮總黃酮質量濃度為0.354 mg/mL時，對DPPH·、·OH、和 O2-·的清除率最大，分別為94.92%、23.96%、18.91%。與相同質量濃度的抗壞血酸相比，其清除·OH和O2-·的能力均低于抗壞血酸，但是當質量濃度＞0.118 mg/mL時，其清除DPPH·的能力大于抗壞血酸。