銀杏葉黃酮的富集及抗氧化活性的研究*

邱福祥 謝懿涵 阮威威 林國榮*

（莆田學院環境與生物工程學院，福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室，福建莆田 351100）

銀杏是我國獨有樹種，資源總量占全世界的90%，銀杏葉產量占世界的70%。銀杏樹被賦予“神奇的醫療之樹”美稱，其作為藥用己有六百多年的歷史。近些年來，國內外學者與科研機構對銀杏葉的活性成分及其分離純化技術、藥理實驗和臨床應用進行了大量的研究工作。銀杏葉中含有的黃酮類化合物種類超過40種，具有極強的清除自由基和抗氧化能力，故而廣泛用于預防和治療心腦血管疾病。銀杏葉提取物在治療和預防疾病方面具有顯著的功效，其應用之廣涉及醫藥、生物農藥、獸藥、食品、化妝品等。

黃酮類化合物廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成份。眾多研究顯示，黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、調節血管滲透等作用，其中最為重要的是黃酮類化合物的抗氧化活性，主要表現在減少自由基的產生和清除自由基兩方面。本試驗通過乙醇浸提法提取銀杏葉黃酮，著重考察大孔樹脂分離銀杏葉黃酮的工藝。通過靜態實驗篩選出適宜富集介質，并動態考察其適宜上樣流速、上樣濃度、洗脫流速、洗脫劑濃度和洗脫量；通過化學方法檢測銀杏葉黃酮對超氧陰離子、羥自由基的清除作用及小鼠常壓耐缺氧試驗，初步了解銀杏葉黃酮的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

干燥銀杏葉，購于莆田紫金藥店；動物，清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體重（20±1.8）g，由福建醫大實驗動物研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

乙醇、AlCl3、Tris、鹽酸、硫酸亞鐵等均為分析純；盧丁標準品，中國藥品生物制品檢定所。

HZ816大孔吸附樹脂，華東理工大學華震科技有限公司；D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附樹脂，天津光復精細化工研究所；聚丙烯酰胺樹脂。

BHZ9146A電熱恒溫干燥器；BS224S電子天平，Sartorius公司；Spectrun752型紫外-可見分光光度計；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵；EYELA N-1000旋轉蒸發儀，EYELA公司；DBS-100自動分部收集器，上海滬西分析儀器廠；THZ-82恒溫振蕩器，江蘇天由有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測定方法

黃酮吸光度測定：取1 mL樣品液于試管中，依序加入0.5 mL質量分數1%AlCl3溶液和2 mL水，混合均勻后靜置10 min，然后于420 nm比色測定，參比對照時，AlCl3改為水，當測定結果不在分光光度計適合范圍內的，則對樣品液進行適當濃縮或稀釋至測定吸光度在0.4～0.9之間。

蘆丁標準溶液的配制：準確稱取蘆丁標準品0.010 0 g，用體積濃度50%的乙醇溶解，并用50 mL容量瓶定容，搖勻，得到蘆丁標準溶液的濃度為0.20 mg/mL。

蘆丁標準工作溶液的配制：分別吸取蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL于10 mL的容量瓶中定容，搖勻配成不同質量濃度蘆丁標準工作溶液進行測定。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.933x-0.004 8，R2=0.999 1。

1.3.2 銀杏葉總黃酮的提取

將銀杏葉置于烘箱干燥，精確稱取一定量，置于燒杯中，并按固液比1 g∶18 mL加入體積濃度65%乙醇，放入HH-4型數顯恒溫水浴鍋中70℃浸提3 h，進行銀杏葉總黃酮提取，提取液經過濾、旋轉蒸發儀濃縮到一定體積，備用。

1.4 銀杏葉黃酮的分離純化

1.4.1 大孔樹脂預處理

將各種型號吸附樹脂經過一定處理后再用乙醇浸泡24 h，并用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.4.2 富集介質篩選

靜態吸附容量的測定：量取已處理好的D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附樹脂、聚丙烯酰胺樹脂各5.0 mL，分別置于100 mL具塞三角燒瓶中，各加入20.0 mL銀杏葉黃酮溶液，蓋緊瓶塞，置于恒溫振蕩器中恒溫振蕩，另取一個具塞三角燒瓶加入20.0 mL銀杏葉黃酮溶液作為對照組一并放入恒溫振蕩器，振蕩9 h充分吸附后,取吸附余液測定銀杏葉黃酮含量，按式（1）計算吸附量，按式

（2）計算吸附率。

將上述各瓶中混合液進行過濾，去除吸附余液，再將其置于錐形瓶中，加入體積濃度65%乙醇30.0 mL，封口置振蕩器中振蕩2 h，檢測各樹脂解析液銀杏葉黃酮含量，按式（3）計算解吸率。

式中：C0——樣液質量濃度，mg/mL；

C——吸附后樣液中總黃酮質量濃度，mg/mL；

V——樣液體積，mL；

Vs——樹脂體積，mL；

C1——解吸液中總黃酮質量濃度，mg/mL；

V1——洗脫劑體積，mL。

1.4.3 樹脂HPD450對銀杏葉黃酮的富集

1.4.3.1 動態吸附

量取15mL處理好的HPD450大孔吸附樹脂，濕法裝柱。基本條件為分別上樣黃酮樣品液150mL，通過改變上樣液流速（1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h）和上樣液質量濃度（0.367 5 mg/mL、0.551 3 mg/mL、0.735 0 mg/mL）的試驗，用分部收集器收集流出液，測定其吸光度，確定最適上樣流速和上樣液質量濃度。

1.4.3.2 動態洗脫

按相同上樣條件進行吸附，上樣量為50 mL黃酮濃縮液用水稀釋成100 mL，吸附后用一定流速和90 mL一定體積乙醇進行洗脫，分部收集測定其吸光度，通過改變洗脫流速（2 BV/h、3 BV/h）和乙醇體積濃度（50%、65%、80%）的試驗，考察其適宜洗脫流速和洗脫液濃度。

1.4.3.3 工藝驗證

按照以上確定的適宜工藝條件重復試驗5次，得到全部洗脫液濃縮后凍干，再稱取一定量凍干品溶于適量乙醇,測定總黃酮吸光度，計算其得率和純度。

1.4.4 銀杏葉黃酮的抗氧化活性

1.4.4.1 銀杏葉黃酮對超氧陰離子的清除作用

取5份5 mL pH8.2 Tris-HCl緩沖液，分別加入提取液質量濃度1/5、2/5、3/5、4/5和提取液5種不同質量濃度銀杏葉黃酮溶液20 μL，再加5 μL 50 mmol·L-1鄰苯三酚，搖勻。以pH8.2 Tris-HCl緩沖液為空白對照，測定不同時間的吸光度，按式（4）計算抑制率。

式中：A0——空白吸光度；

A1——加黃酮樣液的吸光度。

1.4.4.2 銀杏葉黃酮清除羥自由基的作用

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基的方法考察銀杏葉黃酮對羥自由基的清除作用。取4支試管，分別加入0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.40）2 mL、蒸餾水1 mL（第3支用0.735 mg/mL銀杏葉黃酮、第4支用0.5 mg/mLVc代替蒸餾水）、然后各加入0.75 mmol/L新配制硫酸亞鐵溶液1mL和質量分數0.01%新配制雙氧水1mL（其中第2支用溶液用1 mL蒸餾水代替雙氧水）。37℃水浴加熱60 min，在536 nm波長測定的吸光度，測得各支試管的數據分別為：①損傷管的吸光值A損、②未損傷管吸光值A未、③銀杏葉黃酮樣品管吸光度A樣、④Vc陽性對照管吸光度A陽。按式（5）計算清除率。

1.4.4.3 小鼠常壓耐缺氧試驗

昆明種小鼠隨機分為4組（n=6），分別為總黃酮高、中、低劑量組（分別為100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg）和空白對照組（等體積的生理鹽水）。連續灌胃給藥7 d后，把小鼠放入盛有5g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，加蓋密封，以呼吸停止（小鼠胸部不起伏）為指標，記錄小鼠死亡時間。

2 結果與分析

2.1 銀杏葉提取液黃酮含量

按照1.3.2方法提取銀杏葉黃酮，提取液經過濾、濃縮，測定提取液在波長420 nm下的吸光度，按回歸方程計算得提取液黃酮質量濃度為0.735 mg/mL。

2.2 銀杏葉黃酮適宜富集介質的確定

據1.4.2方法篩選富集介質，結果如表1。

由表1可看出各種吸附樹脂吸附性能大小比較為：D101＞HPD450＞HZ816＞AB-8＞ 聚酰胺樹脂；用體積濃度65%乙醇作為洗脫劑的解吸效果比較為：聚酰胺樹脂 ＞HPD450＞D101＞AB-8＞HZ816。由此可知，聚酰胺樹脂洗脫率最高，但是吸附效果并不理想；而HPD450的吸附效果只比D101略小，洗脫率也只比聚酰胺樹脂略小。綜合考慮，選擇HPD450大孔吸附樹脂作為銀杏葉黃酮的富集純化的適宜介質。

2.3 HPD450樹脂對銀杏葉黃酮的純化條件選擇

2.3.1 吸附流速的確定

試驗結果見圖1。

圖1 上樣流速對銀杏葉黃酮吸附的影響

由圖1可知，不同流速下漏出液黃酮的濃度值隨著上樣量的增大而增高，漏出點均在第4管附近；3 BV/h流速吸附效果較差，1 BV/h和2 BV/h條件下吸附率相近，而2 BV/h速率效果略好，節省時間。故適宜流速為2 BV/h。

2.3.2 上樣濃度的確定

試驗結果見圖2。

圖2 上樣液濃度對銀杏葉黃酮吸附的影響

由圖2可看出用0.3675 mg/mL、0.5513 mg/mL、0.735 0 mg/mL3種不同質量濃度黃酮溶液進行上樣，上樣濃度越小則吸附率越高。故適宜上樣液濃度為0.3675mg/mL。

2.3.3 適宜洗脫流速的確定

試驗結果見圖3。

圖3 流速對銀杏葉黃酮洗脫的影響

由圖3可知在3 BV/h和2 BV/h兩種不同洗脫流速的洗脫效果相當，3 BV/h洗脫速率下波峰出現較早且高。考慮到時間問題，確定適宜洗脫流速為3 BV/h。

2.3.4 洗脫劑濃度的確定

試驗結果見圖4。

圖4 乙醇體積濃度對銀杏葉黃酮洗脫的影響

由圖4可知，3種不同濃度乙醇作為洗脫劑時，都在使用50 mL乙醇洗脫后洗脫液黃酮含量顯著變小；體積濃度80%乙醇洗脫曲線峰形較好、無拖尾、洗脫集中；而體積濃度50%乙醇的效果較差，拖尾嚴重。故適宜洗脫劑為體積濃度80%乙醇溶液。

2.3.5 工藝驗證結果

上樣液中銀杏葉總黃酮總量為1.766 g，銀杏葉總黃酮洗脫量分別為1.50 g、1.54 g、1.52 g、1.56 g、1.47 g，平均收集量為1.52 g，平均得率為86.1%；測定并計算得銀杏葉總黃酮純度為34.2%。說明該工藝是可行的。

表2 不同濃度銀杏葉黃酮對超氧陰離子的抑制率

2.4 銀杏葉總黃酮抗氧化活性

2.4.1 對超氧陰離子的清除作用

每隔0.5 min測定一次吸光度，考察銀杏葉提取液對對鄰苯三酚自氧化產生的超氧陰離子自由基的清除作用，結果見表2。由表2可知，空白3 min時的自氧化率為0.076 7 A/min；隨著銀杏葉黃酮濃度的升高，其對超氧陰離子的抑制率也增高；提取液3 min時的氧化抑制率為45.63%。結果表明，銀杏葉黃酮對超氧陰離子的清除作用效果顯著。

2.4.2 對羥自由基的清除作用

通過鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基，考察銀杏葉提取液對羥自由基的清除作用，結果如表3。

表3 銀杏葉黃酮對H2O2/Fe2+產生的羥自由基的清除率

從表3可知0.735mg/mL銀杏葉黃酮對羥自由基的清除率為31.37%，效果明顯，且清除效果好于Vc。

2.4.3 銀杏葉黃酮對小鼠常壓缺氧的影響

小鼠耐缺氧試驗結果如表4。

表4 不同濃度銀杏葉黃酮對小鼠耐常壓缺氧的影響

由表4可知，與生理鹽水對照組比較，黃酮低、中、高劑量組小鼠耐缺氧能力都有不同程度的改善，各劑量組間均有明顯差異，以高劑量組改善耐缺氧能力的效果最為明顯。

3 結論

本試驗選擇的D101、HPD450、HZ816、AB-8吸附樹脂吸附性都較強，其中樹脂HPD450吸附和洗脫效果最佳，其吸附率為98.87%，解析率為71.52%。故選擇大孔吸附樹脂HPD450作為銀杏葉黃酮的富集介質。

考察了大孔樹脂HPD450富集黃酮的適宜工藝參數為：常溫2 BV/h、質量濃度0.367 5 mg/mL上柱吸附，洗脫流速為3 BV/h，洗脫劑為50 mL體積濃度80%乙醇。此條件下得到銀杏葉總黃酮得率為86.1%，純度為34.2 g/100g。

抗氧化試驗表明，銀杏葉黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的抑制作用，并隨著其含量的增加而增加，且在一定范圍內黃酮含量與抑制率呈正相關。銀杏葉黃對羥自由基的清除作用效果顯著。銀杏葉黃酮具有提高小鼠耐缺氧能力的作用。