L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析方法研究

陳錦東　華薇　王玉

【摘 要】L-纈氨酸（L-val）為支鏈氨基酸中的一種，是合成蛋白質(zhì)的素材，也可以作為生物體的能源和前體，目前主要用于氨基酸輸液和氨基酸口服液。L-纈氨酸在國外用途很廣，用它作原料合成N-乙酰纈氨酸具有抗癌功能，本文對(duì)其柱前衍生HPLC分析方法進(jìn)行了探討。

【關(guān)鍵詞】L-纈氨酸;柱前衍生HPLC;分析方法

中圖分類號(hào)： Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）36-0090-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.36.041

0 引言

L-纈氨酸（L-val）和L-異亮氨酸，L-亮氨酸統(tǒng)稱為支鏈氨基酸，目前氨基酸的分析方法有分光光度法、色譜法和電化學(xué)法等。其中，分光光度法一般適合于檢測在紫外區(qū)有吸收的氨基酸，電化學(xué)法僅可檢測具有電活性的氨基酸。色譜法有離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等，其中離子色譜法和高效液相色譜法是應(yīng)用最多的方法[1]。

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，可以分為直接分析、柱前衍生化、柱后衍生化等種類。與其他兩種方法相比，柱前衍生化具有所用設(shè)備簡單，方法通用性、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已經(jīng)得到較大的發(fā)展[2]。

衍生化是一種利用化學(xué)變換把化合物轉(zhuǎn)化成類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。本文探討了L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析過程，以獲得穩(wěn)定可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)方案

1.1 溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.5g2，4-二硝基氟苯（DNFB），用乙醇定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

衍生化緩沖溶液的配制;準(zhǔn)確稱取4.2g碳酸氫鈉加入至100mL容量瓶中，用高純水定容并搖勻備用。定容緩沖溶液的配制;準(zhǔn)確稱取3.4g磷酸二氫鉀，加高純水溶解，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶，加145.5mL0.1moL/L氫氧化鈉混合，用高純水定容至刻度。

流動(dòng)相A的配制;乙腈。

流動(dòng)相B的配制：

準(zhǔn)確稱取4.1g醋酸鈉，加約900mL高純水溶解，用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.4，加N，N-二甲基甲酰胺10mL，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用高純水定容至刻度。

L-纈氨酸樣品溶液的配制

已知在生產(chǎn)L-纈氨酸過程中會(huì)產(chǎn)生的雜氨酸有丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，其中亮氨酸和異亮氨酸最難分離，只要最難分離對(duì)達(dá)到分離，就可視為全部物質(zhì)已經(jīng)分離。稱取L-纈氨酸，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸標(biāo)樣各50mg，混合溶解，用高純水定容至25mL。

1.2 流動(dòng)相梯度條件的選擇

設(shè)初始梯度為0min 流動(dòng)相A：B=5：95，30min結(jié)束梯度為流動(dòng)相A：B=95：5，做出色譜圖，再將難分離的峰的洗脫時(shí)間延長，反復(fù)測定，找出最佳梯度。

色譜柱：THERMO C18柱;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：20μL;流動(dòng)相流速：1.0mL/min

檢測波長：UV360nm

1.2.1 衍生化條件的選擇

取5個(gè)棕色容量瓶，分別加入0.15mL的L-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后再加入1mL衍生試劑，搖勻，將容量瓶置于40℃水浴中暗處恒溫加熱，分別在15min，30min，45min，60min，75min時(shí)取出1個(gè)容量瓶，放置10min待溶液冷至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進(jìn)行色譜分離。

1.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取5個(gè)棕色容量瓶，加入1.5mLL-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后加入1mL衍生化試劑，搖勻，將容量瓶置于50℃水浴中暗處恒溫加熱，在30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始按3.3.4色譜條件進(jìn)行色譜分離。

1.2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

稱取L-纈氨酸標(biāo)樣，丙氨酸標(biāo)樣，亮氨酸標(biāo)樣，異亮氨酸標(biāo)樣各10mg，混合溶解，用高純水定容至10mL，取5個(gè)棕色容量瓶，加入1.5mLL-纈氨酸樣品溶液，再分別加入0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL混合標(biāo)液，1mL緩沖溶液，搖勻后加入1mL衍生化試劑，搖勻，將容量瓶置于50℃水浴中暗處恒溫加熱，在30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始按3.3.4色譜條件進(jìn)行色譜分離。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相梯度條件的選擇

對(duì)比甲醇與乙腈的分離效果，甲醇得到的峰型較差，部分組分沒有完全分離，乙腈分離效果稍好，各峰基線分離效果好。

由于L-纈氨酸樣品中雜氨酸較多，氨基酸的極性不同，用同一梯度分離多種氨基酸，保留時(shí)間相差很大，導(dǎo)致分析時(shí)間過長，要同時(shí)分析幾種氨基酸的含量，需要進(jìn)行梯度洗脫，在保證分離效果的情況下進(jìn)行梯度洗脫減少分析時(shí)間。

梯度洗脫又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。

流動(dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動(dòng)相中各溶劑組成的比例改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品種的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離。

圖1 梯度洗脫示意圖

第一次對(duì)所測物質(zhì)進(jìn)行梯度設(shè)計(jì)時(shí)，由于不知道各個(gè)物質(zhì)洗脫時(shí)流動(dòng)相的比例，可以在一段時(shí)間內(nèi)流動(dòng)相中有機(jī)相由低比例升到高比例進(jìn)行洗脫，然后再對(duì)有重峰，出現(xiàn)拖尾，分析時(shí)間過長等問題進(jìn)行解決，逐步優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相的梯度。

通過實(shí)驗(yàn)可以看出，丙氨酸，L-纈氨酸的峰能夠很好的分離，且峰型尖銳，但亮氨酸和異亮氨酸色譜峰重疊，不能實(shí)現(xiàn)有效分離，且它們的保留時(shí)間較長，需增加這一梯度的洗脫時(shí)間，另外10min前沒有出峰，25min后不再出峰，可以將這兩段的時(shí)間縮短。

通過實(shí)驗(yàn)可看出，亮氨酸和異亮氨酸基本分離，但保留時(shí)間在12min到20min之間沒有物質(zhì)出峰，可以減少這一段分析時(shí)間，以提高分析效率。

通過實(shí)驗(yàn)可看出，各個(gè)物質(zhì)分離效果好，峰型尖銳，對(duì)稱性良好，且分析時(shí)間較短，分析效率較高。因此HPLC確定的色譜條件為：

色譜柱：THERMO C18柱（250×4.6mm，5μm）;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：20μL;流動(dòng)相流速：1.0mL/min;檢測波長：UV360nm。

2.2 衍生化條件的選擇

高效液相色譜的化學(xué)衍生法是指在一定條件下利用某種試劑（通稱化學(xué)衍生試劑或標(biāo)記試劑）與樣品組份進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物有利于色譜檢測或分離。

本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化進(jìn)行L-纈氨酸的分析研究，具體方案：取5個(gè)棕色容量瓶，分別加入0.15mL的L-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后再加入1mL衍生試劑，搖勻，將容量瓶置于40℃水浴中暗處恒溫加熱，分別在15min，30min，45min，60min，75min時(shí)取出1個(gè)容量瓶，放置10min待溶液冷至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進(jìn)行色譜分離。用此方法測定50℃，60℃，70℃時(shí)的峰面積。

以衍生化時(shí)間為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，做出各個(gè)氨基酸在各溫度下的折線圖，找出最佳衍生化溫度和衍生化時(shí)間。

從上述圖中可以看出，一開始衍生化產(chǎn)率較低，隨著衍生化時(shí)間的增加，衍生化產(chǎn)率升高，峰面積先上升再趨于穩(wěn)定，最佳衍生化時(shí)間為30min;隨著溫度的升高，峰面積先增大，隨著溫度的上升，衍生物穩(wěn)定性較差，峰面積略有下降，最佳衍生化溫度為50℃，所以衍生化溫度為50℃，衍生化時(shí)間為30min時(shí)各個(gè)氨基酸的峰面積達(dá)到最大值，檢測效果最好。因此，確定衍生化條件為：取0.15mL氨基酸樣品于10mL棕色容量瓶中，加入配制好的衍生化緩沖液1mL，搖勻后再加入衍生化試劑1mL，搖勻，將容量瓶置于50℃水浴中暗處加熱30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進(jìn)行色譜分離。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用的是高效液相色譜儀，HPLC法具有方法靈活多樣、靈敏度高、分析時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域氨基酸的檢測。用柱前衍生化HPLC法測定發(fā)酵液中L-纈氨酸的含量靈活多樣靈敏度高、分析時(shí)間段、精密度高。采用C18柱，梯度洗脫的分離模式，UV檢測，經(jīng)衍生化試劑衍生化進(jìn)行檢測。用DNFB作為衍生化試劑，價(jià)格低，衍生物穩(wěn)定，適合于定量測定。

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的考察了流動(dòng)相條件，衍生化條件，線性關(guān)系，精密度以及加標(biāo)回收等。最佳實(shí)驗(yàn)條件為：色譜柱：THERMO C18柱 （250×4.6mm，5μm），柱溫：35℃，進(jìn)樣量：20μL，流動(dòng)相流速：1.0mL/min，檢測波長：UV360nm，流動(dòng)相梯度條件：25%A+75%B（0min），40%A+60%B（10min），40%A+60%B（13min），65%A+35%B（15min），65%A+35%B（17min），25%A+75%B（20min）。衍生溫度50℃，衍生時(shí)間30min。

本文選定的是用柱前衍生化HPLC法測定L-纈氨酸的含量，結(jié)果表明在適宜的色譜條件下各個(gè)氨基酸分離良好，線性實(shí)驗(yàn)中，線性相關(guān)系數(shù)良好，重現(xiàn)性好，樣品測定結(jié)果準(zhǔn)確，適合用于L-纈氨酸的檢測分析。

【參考文獻(xiàn)】

[1]李曉華，陳寧，張克旭.化學(xué)比色法測定發(fā)酵液中L-纈氨酸的研究[J].氨基酸和生物資源，2003，25（4）：55～57.

[2]程勇，陳玲，鄧小春.柱前衍生HPLC法測定煙葉種20種游離氨基酸含量[J].煙草化學(xué)，2010，8.