“分解纖維素的微生物的分離”疑點探討

趙 輝 龍秋月 ( 廣東省深圳大學附屬中學 深圳 58054； 廣東省深圳市寶安區(qū)新安中學 深圳 580)

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中生物學教材選修1《生物技術實踐》中的一個課題，主要目的是使學生了解微生物分離的基本原理，掌握從土壤中篩選纖維素分解菌的技術，培養(yǎng)學生基于生物學知識進行工程學思維、參與動手實踐的能力。在實際教學中，師生對教材中的部分內容存在種種疑問，本文梳理并分析了常見的四點疑惑，以期廣大一線教師更好地開展本課題的教學。

1 培養(yǎng)基中為何要添加非纖維素類碳源

教材中分別給出了纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的配方，兩種培養(yǎng)基中都出現(xiàn)了非纖維素類的其他碳源，疑問： 如此一來，是否培養(yǎng)與分離的就不是單純的纖維素分解菌，為什么要配制這樣的培養(yǎng)基呢？

針對為什么在選擇性培養(yǎng)基中添加酵母膏和水解酪素的疑問，在教學時，首先應引導學生關注選擇培養(yǎng)基的目的是為了創(chuàng)造適宜環(huán)境使某種微生物迅速繁殖，而其他微生物受抑制；其次，分析纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基中的碳源含量： 纖維素粉為5 g，酵母膏和水解酪素均分別為0.5 g；再者教材“微生物的實驗室培養(yǎng)”中關于培養(yǎng)基成分的要求： 除了需要碳源、氮源、水、無機鹽等營養(yǎng)物質外，還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。由此，學生理解了在以纖維素粉為主要碳源、并添加少量酵母膏與水解酪素作為生長因子的環(huán)境中，該選擇培養(yǎng)基才可以更好起到富集培養(yǎng)的作用。

針對鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基添加含有淀粉的土豆汁可能引起假陽性的疑問，要明確： ①剛果紅可以與纖維素之外的其他多糖(如淀粉)發(fā)生顯色反應；②用稀釋涂布平板法對微生物進行鑒定要求平板上至少可以形成單個菌落；③由于微生物本身酶系統(tǒng)的影響，不同微生物對碳源的利用是有選擇性和順序性的。一般情況下，微生物會優(yōu)先利用淀粉，淀粉耗盡才會利用纖維素。在CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，微生物繁殖的速度很慢。在涂布后，為使單個微生物存活并發(fā)展為菌落，可以在鑒別培養(yǎng)基中加入適量土豆汁滿足纖維素分解菌株早期快速生長代謝的需求，效果比僅以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基更明顯。這是由于土豆汁中除了含有淀粉外，還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質，以及維生素A、維生素C和B族類維生素，營養(yǎng)豐富，有利于微生物的繁殖。不過土豆汁的濃度不宜過大，一開始分解淀粉的微生物也會繁殖，但由于加入的淀粉量較少，隨著淀粉的消耗，這些微生物的生命活動會逐漸受到抑制，最后只剩下纖維素作為唯一碳源，此時纖維素分解菌則能繼續(xù)利用纖維素繁殖并形成菌落，這也是為什么剛果紅染色法中產淀粉酶的微生物周圍形成的透明圈較為模糊的原因。

2 是否可以用纖維素粉代替CMC-Na

針對是否可用纖維素粉替代的疑問，通過查閱文獻可知： ①在纖維素剛果紅培養(yǎng)基中，使用CMC-Na作為唯一的碳源，可以保證獲得的菌株具有分解纖維素的高效性;②CMC-Na并非碳源的唯一選擇，也可以利用結晶纖維素為唯一碳源并結合剛果紅染色法來篩選菌株;③普通的纖維素粉也可以成為唯一碳源，只不過在配制前，應對纖維素粉和瓊脂進行預處理(纖維素粉加1 mol/L HCl溶液浸泡12 h，然后蒸餾水洗多次至pH達中性，再過濾、烘干)，以除去藥品中可能存在的其他碳源;④有研究發(fā)現(xiàn)，鑒別培養(yǎng)基中不設置唯一碳源會達到更理想的效果[1]。所以，教材中纖維素分解菌的選擇和鑒別培養(yǎng)基配方僅僅是一種參考，可以進行適當變動或改進。

3 為何透明圈中的纖維素分解菌菌落本身會呈現(xiàn)紅色

針對教材中圖2-13中透明圈中的纖維素分解菌菌落本身為何會呈現(xiàn)紅色的疑問，分析實驗可知，在剛果紅—纖維素固體培養(yǎng)基上，纖維素被水解后，菌落周圍顏色變淺形成透明圈，顏色濃郁的紅色物質主要集中在菌落生長區(qū)域；透明圈中紅色物質主要集中在菌絲中，菌絲周圍的紅色顯著變淺甚至無色。

研究表明，纖維素類物質被微生物分泌的酶水解后形成大量含有β-1， 4-D-吡喃型葡萄糖與β-1， 3-D-葡聚糖及乳糖-葡甘露糖聚合糖等結構的物質，與剛果紅染料結合形成大量的紅色多聚糖-剛果紅復合物，菌絲吸收多聚糖-剛果紅復合物，使剛果紅也伴隨著多聚糖進入了菌絲體，所以菌絲周圍培養(yǎng)基的顏色變淺甚至無色[2]。而進入菌絲中的多聚糖-剛果紅復合物進一步被真菌分解為可以利用的小分子多糖加以吸收，無法被利用的剛果紅染料則沉積在菌絲中，或進入菌絲與真菌細胞中的葡聚糖成分再次結合，形成多聚糖-剛果紅復合物，使剛果紅固定在細胞內，最終使菌絲呈現(xiàn)紅色。

4 以透明圈大小作為菌株產纖維素酶活力大小的定量指標是否可靠

剛果紅染色法是目前公認的一種有效分離纖維素分解菌方法。實驗發(fā)現(xiàn)，即使是低活菌株也能形成清晰的水解圈，具有明顯的可識別性。這是由于纖維素酶是一種復合酶,由C1酶(內切葡聚糖酶： 這類酶作用于纖維素分子內部的非結晶區(qū)，隨機水解β-1， 4糖苷鍵，將長鏈纖維分子截斷，產生大量非還原性末端的小分子纖維素)、Cx酶(外切葡聚糖酶： 作用于纖維素分子的非還原端，依次水解β-1， 4糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子)和葡萄糖苷酶(水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降)組成。它們一起組成復合酶系，實際的降解過程是多種組分共同催化水解的結果。但在實踐中，測定這三種組分酶酶活力所用底物分別是脫脂棉、CMC-Na和對硝基酚-β-葡萄糖苷，所以在降解梭甲基纖維素(CMC)時，菌落透明圈大小只能表征Cx酶活力高低，并不能反映微生物分解纖維素的真實能力。

另外，雖然可根據(jù)透明圈的大小以及出現(xiàn)的遲早粗略估計菌株產酶情況，卻不能真正代表菌株的產酶能力，僅以水解圈大小作為菌株產纖維素酶活力大小的唯一定量指標是不太可靠的。因為發(fā)酵生產中體積生產率(volume productivity)即單位質量菌體，單位時間內合成目標產物的數(shù)量是生產成本的決定性因素。但在菌種選育和條件優(yōu)化試驗中，都習慣以單位體積的產物量為依據(jù)，忽略了時間和菌體量這兩個制約因素，其結果往往使發(fā)酵周期長、生產效率低的菌株被作為目標菌株投入大生產。

綜上，為確定得到的是纖維素分解菌，進行發(fā)酵產纖維素酶的復篩實驗必不可少。實驗室一般用濾紙作為底物，因為濾紙是聚合度和結晶度都居中等的纖維性材料，結構較為松散，非還原性末端也較多，容易同時被內切酶和外切酶降解，再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等還原糖，此時用比色法定量測定還原糖的生成量，才可反映纖維素酶的總酶活力。