“分解纖維素的微生物的分離”實驗的細節補充

陳 婷 王怡坤 俞如旺

(福建師范大學生命科學學院 福州 350117)

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中教材選修1中的一個實驗，包括土壤取樣、選擇性培養纖維素分解菌、菌懸液的濃度梯度稀釋、涂布平板法分離細菌、纖維素分解菌的觀察與鑒定等步驟。本文對該實驗的操作步驟進行一些細節補充，能夠有效地提高該實驗的成功率，激發學生的學習興趣，提高學生對微生物的分離、培養與鑒別能力。

1 土壤取樣

收集富有纖維素分解菌的土壤樣品，應選擇纖維素豐富的土質。如花盆土、多年積累的枯枝敗葉、腐殖土等[1]。具體操作： 在校園中選擇落葉豐富的區域，撥開樹葉，用小鏟取葉下腐殖質豐富的土壤。在報紙上將土壤碾碎，并用鑷子取出土壤中較大的沙石、樹葉、樹根、蟲卵等物質，將剩余土壤放入無菌袋中備用。需注意的是： 選取土壤樣本時切勿選用過于疏松，含大量樹葉、樹根的土壤。因為，此類土壤在搖床培養時會出現大量碎屑，影響菌懸液濃度梯度稀釋過程中的菌液采集。

如若校園中無法找到合適的、富有纖維素的土壤，也可以將濾紙埋在約10cm深的土壤處，一段時間后即可獲得具有分解纖維素能力的大量微生物。人教版高中教材選修1中提及： 將濾紙埋在土壤中，30d左右能夠從濾紙中獲取大量纖維素分解菌。但筆者利用校園環境，將濾紙埋在夏季溫暖、濕潤的校園花園中，僅需7d左右便可從濾紙上獲取大量纖維素分解菌。

2 選擇性培養纖維素分解菌

利用纖維素分解菌的選擇性培養基，可使土壤混合菌落中的纖維素分解菌成為優勢種群，從而在液體培養基中大量富集。具體操作： 按照纖維素分解菌的選擇培養基配方配置30mL的培養基倒入錐形瓶中，封口后在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。在無菌環境下，稱取6～10g土壤于選擇性培養基中，置于30℃、250rpm的搖床培養1d左右至培養基變混濁，取上層懸液備用。

但筆者經反復實驗得出，忽略選擇性培養纖維素分解菌這一步驟，直接將土壤溶于生理鹽水中，制備菌原液能夠獲得更好的實驗效果。其原因有二： ①選擇性培養纖維素分解菌的過程易受培養時間、溫度等因素影響；②過度培養土壤懸液中的各種細菌，會導致選擇性培養基中菌量過大，反而造成培養基中含氧量降低、營養物質減少等結果，最終影響土壤中纖維素分解菌的菌種豐富度。

因此，若忽略選擇性培養纖維素分解菌后，將土壤溶解于生理鹽水中，可制備土壤樣品在生理鹽水中的菌懸液。具體操作： 將6g土壤樣品加入30mL生理鹽水中，置于30℃、 250rpm的搖床上，振蕩培養0.5～1h左右，取上層懸液備用。該操作能夠使土壤中的各種微生物充分溶于生理鹽水，提取出較為原始的土壤菌群。

3 菌懸液的濃度梯度稀釋

選擇性培養基制備的菌懸液中菌濃度極高，若以其作為母液，直接接種于鑒別性培養基上，會導致鑒別性培養基中菌的分布過于密集，從而出現菌落重疊的現象，不利于后續的觀察。因此，在實際操作中應以選擇性培養基中的菌液或生理鹽水中的菌液作為菌原液，進行密度梯度稀釋。該操作可以有效降低培養基中的菌數，便于培養出單菌落，從而進行后續的實驗。具體操作： 取一支試管，加入9mL生理鹽水和1mL菌懸液并搖勻，制成濃度為10-1菌懸液；在濃度為10-1菌懸液中取1mL懸液加入另一支裝有9mL生理鹽水的試管中并搖勻，制成濃度為10-2菌懸液。按照上述操作，可依次制備出10-1～10-6濃度梯度的菌懸液。富集培養后的菌懸液一般需要將濃度稀釋至10-2～10-4，才能容易將菌落分散開，出現清晰的單一菌落；而未富集培養的菌懸液一般是將菌懸液濃度稀釋至10-2～10-3最為適宜。

值得注意的是，筆者在實驗操作中兩次以無菌生理鹽水取代教材中提及的無菌水，進行土壤樣品溶解、制備菌原液及菌懸液的濃度梯度稀釋等步驟。原因在于： 生理鹽水不僅是人體細胞的等滲液，也是細菌細胞的等滲液，能夠維持細菌的形態、結構，使其保持生命活性。并且生理鹽水能夠為細菌細胞的生命活動提供所需的無機鹽，有利于細菌生長。

4 涂布平板法分離菌株

采用涂布平板法將稀釋后的菌懸液接種至鑒別培養基中，能夠使懸液中的菌均勻地分散在培養基上，便于對纖維素分解菌的觀察、鑒別、計數與挑選。具體操作： 將制備好的菌懸液搖勻后，選擇濃度適宜的菌懸液進行涂布平板。在無菌條件下，用移液槍取0.1mL菌懸液至瓊脂固體培養基中，并用涂布棒將菌液均勻地涂布在培養基上，室溫放置2～3min，使菌液完全被培養基吸收。用封口膜封口，將培養基倒置在30℃左右的恒溫箱中培養1～2d即可。培養基倒置培養，可以防止在培養菌的過程中產生的水滴落到培養基上，沖散菌落。

若條件允許，可在接菌前，預先倒好培養基，待培養基凝固后，將其倒扣并置于32℃左右的恒溫箱中烘干2～3h。該做法能有效減少培養基中的水分，使菌液更快被培養基吸收，避免培養基染菌或出現水痕。

5 纖維素分解菌的觀察與鑒定

快速鑒別纖維素分解菌的方法有很多，其中剛果紅染色法是目前比較常用的一種鑒別的方法[2]。剛果紅能夠與纖維素形成紅色復合物，因此可用其鑒定纖維素或纖維素分解菌。將剛果紅加入固體培養基中，剛果紅與培養基中的纖維素形成紅色復合物，因此培養基呈現紅色；含有纖維素分解菌的菌落，由于纖維素分解菌分解其周圍纖維素，因此其周圍的纖維素含量較低或無纖維素的存在，則菌落周圍無紅色復合物形成，因而出現以菌落為中心的透明圈。其中，常用的剛果紅染色法有兩種，具體操作如下：

方法一： 將適量的剛果紅加入尚未凝固的培養基中，充分溶解，可配置出纖維素分解菌的鑒別性培養基。再進行菌落接種的培養，從而觀察單一菌落周圍培養基的情況。為使纖維素分解菌周圍的透明圈更易觀察，須將培養基置于白色背景，如白色硬紙板前；并適當地調節觀察角度，可明顯觀察到部分菌落周圍存在透明圈。調節剛果紅的濃度，使其在培養基中的濃度適當，能更容易觀察到透明圈。經筆者反復實驗、比較得出，當剛果紅在培養基中的濃度約為0.3g/L時，培養基既能保持一定透明度，又能和透明圈出現明顯色差。

方法二： 先在固體培養基中培養菌群，待菌落長出，加入適量1mol/L的剛果紅溶液染色，等待15min后倒去培養皿內的剛果紅與浮起的菌落。再加入適量1mol/L的NaCl溶液漂洗一次，洗去浮色。

比較兩種方法，以方法一進行纖維素分解菌的觀察與鑒定能更容易觀察到菌落的實際大小、形態。以方法二進行纖維素分解菌的觀察與鑒定雖然可以在培養基上觀察到較為明顯的透明圈，但形態結構較為光滑的細菌染色、漂洗過程中容易浮起并被帶走，因此不利于菌落的形態的觀察，難以保留菌種。

(基金項目： 教育部人文社會科學研究規劃基金項目“核心素養導向的科學課程高中學業水平考試實施策略與命題研究”，No.17YJA880088;*通信作者)