香附揮發(fā)油誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用

，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

目前，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是世界公認(rèn)的“癌癥之王”。近年來，受城市工業(yè)化進(jìn)程的加速、環(huán)境污染和吸煙人群增多等因素的影響，肺癌的發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì)。2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[1]：中國癌癥總發(fā)病429.16萬例，總死亡281.42萬例，2015年全國肺癌發(fā)病73.33萬例，死亡61.02萬例,取代肝癌成為惡性腫瘤之首。如此高的發(fā)病率及死亡率表明現(xiàn)有治療肺癌的藥物療效較差，急需大力研發(fā)高效低毒的抗肺癌新藥。

香附是常用的中藥之一，主要用于治療肝郁氣滯、胸肋脹痛、脾胃氣滯和月經(jīng)不調(diào)等病癥。活性成分主要為揮發(fā)油(含單萜、倍半萜、黃酮類、糖類、生物堿、酚類及三萜類化合物)[2]，其中α-香附酮和α-香附烯為主要成分，占揮發(fā)油成分的28.85%[3]。單味香附抗肺癌方面的研究未見報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：利用超臨界CO2萃取香附揮發(fā)油(ACA)，對(duì)正常細(xì)胞毒性較小，能殺死多種癌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺腺癌細(xì)胞A549購自上海中科院細(xì)胞所。

1.1.2 試 劑

香附購自杭州中藥飲片廠；RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶和PBS購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MTT(噻唑蘭)、DMSO和Rhodamine123購自SIGMA公司；澳洲胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自CLARK Bioscience公司；注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司，批號(hào)H20023461；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；Fura-2 AM鈣離子熒光探針試劑盒、ATP含量測(cè)定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀 器

超臨界CO2萃取裝置(南通華安超臨界萃取有限公司，型號(hào)HA221-50-03)；生物安全柜(Nuaire，型號(hào)NU-425-400S)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo electron corporation，型號(hào)NU-5510E)；倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon eclipse，型號(hào)TS100-FDH1)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek，型號(hào)synergy HI)和離心機(jī)(Heraeus，型號(hào)LDZ5-2)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Thermo，型號(hào)Z36HK)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界CO2裝置萃取香附揮發(fā)油成分

將香附研磨成粉，取1 kg置萃取釜中，萃取條件：溫度55 ℃，壓強(qiáng)20 MPa，時(shí)間4 h[4]。萃取率計(jì)算公式為

萃取率=(ACA質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

收集對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10% FBS)制成細(xì)胞懸液，以103個(gè)/孔接種于96孔板，置于37 ℃，5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h。設(shè)正常組(RPMI-1640培養(yǎng)液)，不同質(zhì)量濃度ACA和順鉑(cisplatin, DDP)陽性對(duì)照組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用時(shí)間分別設(shè)置為24，48，72 h。采用MTT法，用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，研究不同質(zhì)量濃度的藥物作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，以確定藥物致A549細(xì)胞死亡作用及其量-效、時(shí)-效關(guān)系和IC50(半數(shù)致死質(zhì)量濃度)。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為

抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白)/(OD正常組-OD空白)×100%

1.2.3 LDH，SOD活性及MDA濃度檢測(cè)

采用1.2.2方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及接種。分別設(shè)置正常組(RPMI-1640培養(yǎng)液)，不同質(zhì)量濃度ACA組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，收集細(xì)胞上清液按照試劑盒說明書檢測(cè)LDH活性，裂解細(xì)胞后按照試劑盒說明書檢測(cè)MDA濃度及SOD活性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧^察ACA致A549細(xì)胞凋亡

細(xì)胞培養(yǎng)及接種方法同1.2.2。分別設(shè)置正常組(RPMI-1640培養(yǎng)液)、ACA組(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，終質(zhì)量濃度為140μg/mL)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物分別作用3，6，12 h后，棄去上清，用PBS清洗3次，每孔分別加入40 μL Binding Buffer+5 μL Annexin V-EGFP室溫避光反應(yīng)15 min，再加入5 μL PI室溫避光反應(yīng)15 min。熒光顯微鏡下觀察、拍照[5-6]。

1.2.5 A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定

同1.2.2方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、接種和分組。用不同質(zhì)量濃度ACA作用24 h后，棄去培養(yǎng)液后，PBS清洗3次。用RPMI-1640培養(yǎng)液將2 mmol/L Fura-2 AM稀釋至5 μmol/L，每孔加入40 μL,在37 ℃孵育1 h，激發(fā)波長為340 nm和380 nm，發(fā)射波長為510 nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。用340 nm和380 nm熒光的比值來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度[7-8]。

1.2.6 A549細(xì)胞內(nèi)ATP濃度測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，分別設(shè)置正常組(RPMI-1640培養(yǎng)液)，不同質(zhì)量濃度ACA組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后,按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度[9]。

1.2.7 A549細(xì)胞線粒體膜電位(Δψ)檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)、接種和分組方法同1.2.2。用不同質(zhì)量濃度ACA作用24 h后，棄去培養(yǎng)液后，PBS清洗3次，加入含10 μg/mL Rh 123的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗多次至背景較淺，加入適量無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察、拍照。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm[10]。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用(Mean±SD)表示，采用One-way ANOVA檢測(cè)均數(shù)差異顯著性，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 超臨界CO2裝置萃取ACA

萃取獲得棕黃色油狀液體，萃取率為1.045%。

2.2 ACA對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用

2.2.1 A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

細(xì)胞形態(tài)變化(×200)見圖1,正常組隨時(shí)間延長細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)呈扁平不規(guī)則多角形。不同質(zhì)量濃度ACA組，隨質(zhì)量濃度增加，作用時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，形態(tài)變圓，細(xì)胞膜皺縮，出現(xiàn)膜泡樣變、體積縮小、核固縮，表現(xiàn)凋亡特征性變化，最終解體。本結(jié)果提示ACA誘導(dǎo)A549凋亡的可能性，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步確定。

圖1 ACA作用24 h致A549細(xì)胞形態(tài)變化(200倍)Fig.1 ACA induced morphological changes of A549 cells after 24 h (×200)

2.2.2 ACA對(duì)A549細(xì)胞毒性作用的量-效、時(shí)-效關(guān)系

順鉑(DDP)屬于鉑類配合物，是臨床上常用的一線抗癌藥物，療效肯定，具有破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，是一種廣譜的細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，常用于肺癌、前列腺癌和頭頸部磷狀細(xì)胞癌等的治療，因此選DDP為陽性對(duì)照藥。

當(dāng)ACA質(zhì)量濃度范圍在48～286 μg/mL，作用時(shí)間分別為24，48，72 h，隨著質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長，A549細(xì)胞活力逐漸降低，有明顯量-效和時(shí)-效依賴關(guān)系(圖2)。本部分結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1) ACA效能極強(qiáng)，光鏡下可見能完全殺死肺癌細(xì)胞，遠(yuǎn)高于DDP；2) 相較正常組，當(dāng)ACA質(zhì)量濃度為286 μg/mL，作用24 h時(shí)，細(xì)胞活力抑制率達(dá)99.8%(P<0.001)；作用2 d，200 μg/mL也達(dá)同一峰效應(yīng)；表明ACA殺傷癌細(xì)胞起效快,效能強(qiáng)，提示可以用短期沖擊治療；3) 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DDP為4 μg/mL，作用72 h,對(duì)正常肝細(xì)胞活力抑制率為97.9%,已超過臨床可接受的毒性范圍，因此本研究為比較抗癌效能而采用這一質(zhì)量濃度；而ACA 140 μg/mL,作用72 h,對(duì)正常肝細(xì)胞活力的抑制率為50.1%,考慮到肝細(xì)胞再生能力強(qiáng)，ACA對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性在可接受范圍[4]。結(jié)果表明：ACA比DDP更適于肺癌治療，治療質(zhì)量濃度范圍以98～200 μg/mL為宜。作用時(shí)間為24，48，72 h,ACA的IC50分別為161.47,126.35,72.37 μg/mL，即ACA對(duì)肺癌細(xì)胞的毒性隨著作用時(shí)間延長而增大。圖2中,與正常對(duì)照組(0質(zhì)量濃度，下同)比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖2 DDP和ACA對(duì)A549細(xì)胞毒作用的量-效和時(shí)-效關(guān)系Fig.2 Dose-and time-cytotoxic effect relationship of ACA on A549 cells

2.2.3 ACA誘發(fā)A549細(xì)胞LDH釋放

乳酸脫氫酶(LDH)是細(xì)胞內(nèi)酶，細(xì)胞膜受損致LDH漏出，故培養(yǎng)上清液中LDH活性測(cè)定可間接反映細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷乃至死亡情況。如圖3所示，ACA質(zhì)量濃度依賴性增加，LDH釋放增多，最小有效質(zhì)量濃度為69 μg/mL。該結(jié)果與MTT法測(cè)細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。圖3中,與正常對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧^察ACA致A549細(xì)胞凋亡

ACA(140 μg/mL)作用不同時(shí)間后，經(jīng)Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧?×200)，細(xì)胞變化見圖4，正常組細(xì)胞未著色，ACA作用3 h時(shí)細(xì)胞呈綠色，提示細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期(膜損傷)。6 h時(shí)少量細(xì)胞呈紅綠雙染，12 h時(shí)大量細(xì)胞呈紅綠雙染，表明這些細(xì)胞不可逆死亡。本結(jié)果表明：ACA殺傷細(xì)胞的主要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能少量細(xì)胞發(fā)生壞死；ACA起效時(shí)間短，12 h即可殺死大量癌細(xì)胞。

圖3 ACA致A549細(xì)胞LDH釋放Fig.3 Effects of ACA on LDH levels in A549 cell

圖4 Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧?200倍)Fig.4 Fluorescence images of Annexin V-EGFP/PI double staining(×200)

2.4 ACA致A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載

作為細(xì)胞死亡信號(hào)[11-12]，Ca2+超載能引起氧化應(yīng)激，激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性線粒體途徑、細(xì)胞壞死和自噬過程。Fura-2 AM是一種可以穿透細(xì)胞的熒光染料，其進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)酯酶剪切成水溶性Fura-2，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)ura-2可以和鈣離子結(jié)合，在330～350 nm激發(fā)光下產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，在380 nm激發(fā)光下則會(huì)導(dǎo)致熒光減弱。用340 nm和380 nm這兩個(gè)熒光比值來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是國際常用經(jīng)典方法。

如圖5所示，相較正常組，隨ACA質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增高(P<0.05，P<0.001)，提示ACA可致細(xì)胞內(nèi)鈣超載,參與細(xì)胞死亡過程。

圖5 ACA致A549細(xì)胞Ca2+超載Fig.5 ACA increases Ca2+levels in A549 cells

2.5 ACA致A549細(xì)胞氧化損傷

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA的濃度反映脂質(zhì)過氧化程度。超氧化物歧化酶(SOD)活性高低則能間接反映細(xì)胞清除氧自由基的能力。測(cè)定兩者可以反映細(xì)胞氧化損傷的情況。當(dāng)細(xì)胞抗氧化能力減弱，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)堆積，引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，是理化因子誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要觸發(fā)方式[13]。

如圖6所示，隨ACA質(zhì)量濃度漸增，細(xì)胞內(nèi)MDA濃度不斷增加，而SOD活力不斷下降，表明ACA呈質(zhì)量濃度依賴性引起A549細(xì)胞氧化損傷。圖6中，與正常組相比較，**P<0.01，***P<0.001。

圖6 ACA致A549細(xì)胞氧化損傷作用Fig.6 Oxidative effects of ACA on A549 cells

2.6 ACA致A549細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少

如圖7所示，與正常組相比較，隨ACA質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度明顯減少(P<0.05，P<0.001)，尤其ACA質(zhì)量濃度為286 μg/mL時(shí)，ATP濃度接近為0。說明ACA誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用，與其導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝異常有關(guān)。

圖7 ACA致A549細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少Fig.7 ACA decreases ATP levels in A549 cells

2.7 ACA致A549細(xì)胞線粒體膜電位(Δψ)崩潰

線粒體是真核細(xì)胞生物能量和代謝的中心，也是在細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器。不僅線粒體的原發(fā)性損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡性死亡和非凋亡性死亡，而且也參與其他信號(hào)通路誘發(fā)的凋亡進(jìn)程，因此線粒體也被稱為細(xì)胞死亡信號(hào)整合器(Death signal integrator)[14]。當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，受體釋放Ca2+,并迅速移至線粒體，并被其膜上的鈣蛋白攝取，促進(jìn)線粒體通透性相變孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放。研究證明：氧化、毒素或缺血和缺氧等病理因素所致的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡時(shí)，首先引起線粒體膜滲透性改變[15]，細(xì)胞色素C釋放到胞漿[16]，線粒體膜上的氧化呼吸鏈電子傳遞中斷，氧化磷酸化失偶聯(lián)，導(dǎo)致ATP合成受阻，基質(zhì)Ca2+外流，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失，Δψ崩潰。Rh 123為膜電位敏感的親脂性陽離子熒光染料，能選擇性地在活細(xì)胞線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出黃綠色熒光，其強(qiáng)度可以間接反映線粒體膜電位(Δψ)的高低。

如圖8所示，正常組細(xì)胞線粒體呈黃綠色，表明細(xì)胞線粒體膜完整。相較正常組，當(dāng)ACA質(zhì)量濃度達(dá)69 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)線粒體腫脹，如圖9所示，相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)。隨ACA質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞攝取Rh 123能力逐漸下降，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸減弱(P<0.001)，ACA質(zhì)量濃度達(dá)286 μg/mL時(shí)線粒體形態(tài)已不可見。結(jié)果表明：ACA致A549細(xì)胞凋亡和致線粒體嚴(yán)重?fù)p傷，與MPTP開放導(dǎo)致Δψ崩潰有關(guān)；線粒體損傷，激活線粒體凋亡通路，是ACA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要分子機(jī)制。圖9中，與正常組相比較，*P<0.05，***P<0.001。

圖8 Rh 123熒光染色(200倍)Fig.8 Fluorescence images of Rh 123 staining(×200)

圖9 ACA致A549細(xì)胞線粒體膜電位Δψ崩潰Fig.9 Stimulative effect of ACA on Δψ dissipation of A549 cells

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)主要研究ACA體外抗人肺腺癌細(xì)胞A549的作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ACA對(duì)A549細(xì)胞有極強(qiáng)殺傷作用，呈良好的量-效和時(shí)-效依賴關(guān)系。相較臨床上常用抗癌藥DDP,ACA起效時(shí)間短，在高質(zhì)量濃度下可100%殺死肺癌細(xì)胞，殺瘤效能強(qiáng)大，達(dá)到了研發(fā)抗癌藥物希望的極致效果。通過光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧^察均證明ACA通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗癌作用。鈣超載、氧化應(yīng)激和能量代謝障礙是細(xì)胞凋亡的始發(fā)因素，這3種因素相互影響，互為因果。作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ACA致A549細(xì)胞發(fā)生Ca2+超載,氧化損傷,ATP合成受阻,能量代謝障礙。這3種因素合力，可以解釋ACA強(qiáng)力殺瘤作用。能量代謝是線粒體的主要功能,氧化損傷的主要部位也是在線粒體。用羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位(Δψ)，發(fā)現(xiàn)ACA致線粒體膜電位崩潰，證明ACA作用主要靶細(xì)胞器是線粒體，通過致線粒體功能喪失,啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡通路致細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明：ACA通過激活內(nèi)源性凋亡通路，強(qiáng)力誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗肺癌作用,在抗肺癌藥物開發(fā)方面具有良好的前景。