干酪中抗氧化肽的研究進展

宋雪梅，梁琪，張炎，吳晗

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，蘭州 730070）

0 引 言

食品中活性氧自由基將削弱食品的感官性狀，導致食品品質下降、貨架期縮短。雖然通過加入人工合成的抗氧化劑能夠改善食品的感官性狀，但是對人體存在潛在危害。在這情況下，食源性抗氧化劑由于具有低毒等特點，受到關注。抗氧化肽是一種小分子量短肽，含有豐富的必需氨基酸，活性較高，易于被機體吸收，具有阻止自由基形成、清除自由基和活性氧等作用。大量研究表明：提高抗氧化肽攝入量可以降低疾病發生率[1-2]。

干酪是全球貿易量最大的乳制品之一，營養價值高，富含蛋白質、短鏈脂肪酸、礦物質和維生素等，因此，也是許多生物活性物質的重要來源。干酪中發現的生物活性物質有功能性多肽、脂肪酸、有機酸、共軛亞油酸等。其中，具有抗氧化活性的多肽已在Cheddar[3]、Parmigiano-R eggiano[4]、農家干酪[5]中發現。干酪抗氧化肽不但能阻止其貯藏過程中氧化反應的發生，增加干酪營養價值[6]，且在減少機體心血管疾病發生，抑制腹部脂肪積累，阻止代謝綜合證產生等方面也具有作用[7]。因此，本文主要就干酪抗氧化肽的形成機理、提取方法、形成的影響因素及特征等進行綜合闡述，以期為提高干酪抗氧化性，開發功能性干酪提供參考。

1 干酪抗氧化肽的形成機理

大多數生物活性肽在原蛋白或沒有被激活時無活性，只有通過胃腸系統被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解后或者被乳酸菌的蛋白酶和肽酶所降解后，才能顯示生物活性。αs-酪蛋白，β-酪蛋白、κ-酪蛋白經胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解后，所有蛋白降解產物的抗氧化性呈增加趨勢，且κ-酪蛋白降解的肽的抗氧化性增加了3倍[6]。Stracchino軟質干酪經胃腸系統消化發現，源自β-酪蛋白的六肽EAMAPK和AVPYPQ含量高，且抗氧化活性強[8]。不同菌種Mozzarella干酪的蒸餾水、p H 4.6醋酸緩沖液和12%三氯乙酸可溶性肽在模擬胃腸液環境下均具有一定抗氧化活性[9]。

除此之外，干酪本身在生產過程中也產生抗氧化肽。酶凝干酪，需經歷2周（如Mozzarella干酪）甚至2年（如Parmigiano-Reggiano干酪和Cheddar干酪）以上成熟。干酪成熟對干酪特有風味和品質的形成具有重要影響。在此過程中，酪蛋白在纖溶酶、殘余凝乳酶等作用下降解為中等分子量的寡肽，再在乳酸菌所含有的蛋白酶和肽酶作用下不斷生成小分子多肽。多肽不斷被降解，而另一些多肽又不斷形成和積累[10-11]。源自乳酸菌參與蛋白質降解的物質有3類，分別是降解酪蛋白的細胞壁蛋白酶、運送多肽到細胞內的轉運蛋白和降解寡肽為小分子多肽和游離氨基酸的細胞內肽酶[12]。已發現5種細胞壁蛋白酶，對疏水性酪蛋白具有強烈的傾向性。伴隨著干酪成熟過程中的蛋白質降解，特異性生物活性多肽如抑菌肽、降血壓肽、抗氧化肽等被釋放。一些生物活性肽能夠抵制肽酶消化，被機體吸收后，進入血管，對機體產生有益作用[13]。相關研究表明已在Cheddar[3]、Coalho[14]、Quesofresco[15]、Parmigiano-Reggiano[4]等干酪中發現了具有抗氧化作用的生物活性肽。

綜上所述，除了干酪經人體消化后產生抗氧化肽外，干酪中抗氧化肽主要源自其成熟過程中的蛋白質降解產物，影響蛋白質降解的因素如發酵劑、凝乳酶、干酪的理化性質如pH、鹽含量、成熟溫度等均影響到干酪中抗氧化肽的形成與積累。

2 干酪抗氧化肽的提取

多肽濃度越高,對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（簡稱DPPH）自由基的清除能力越強[16]。干酪抗氧化性與其抗氧化肽有關。目前，干酪抗氧化肽的提取主要采用以下方法：直接蒸餾水提取，或蒸餾水提取后再將pH調整到4.6的提取法；pH 4.6醋酸緩沖液提取法；12%三氯乙酸提取法；乙醇提取法；磷酸緩沖溶液提取后再用鹽酸將p H調到4.6的提取法。

研究發現，Blue、Danablue、Pont-l'Eveque、Munster、Camembert和Brie等干酪水溶性肽和70%乙醇可溶性肽均具有顯著抗氧化活性[17]。巴西Coalho干酪水溶多肽提取物具有抗氧化活性[14]。馬玲等研究了不同菌種Mozzarella干酪蒸餾水、p H 4.6醋酸緩沖液和12%三氯乙酸提取物的抗氧化活性，發現12%三氯乙酸提取物中多肽含量最高，其抗氧化活性最強[18]。

MEISTER MEIRA等通過對Roquefort干酪p H 7.0磷酸鹽提取，1 mol/L鹽酸沉淀后的上清液質譜鑒定，發現源自β-酪蛋白的HKEMPFPKYPVQPF具有抗氧化活性，YQEPVLGP對3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（簡稱ABTS）自由基具有清除作用[19]。MUSHTAQ等采用類似方法提取的不同溫度儲藏的Himalayan干酪中含有水溶性多肽的提取物對DPPH、ABTS自由基均具有清除作用[20]。目前，在干酪抗氧化作用研究中，較多采用了以蒸餾水或者磷酸緩沖溶液作為提取溶劑，再將p H調整到4.6的提取方法獲得提取物，水溶性提取物中含有具有抗氧化作用的多肽，即抗氧化肽粗品。

3 影響干酪抗氧化肽形成的因素

3.1 發酵劑

生產發酵乳制品所用的發酵劑有嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌等。在干酪生產中，發酵劑除了參與凝乳外，還參與干酪成熟。發酵劑含有的細胞壁蛋白酶、肽轉運蛋白、胞內肽酶等參與蛋白質降解，使之產生一些具有抗氧化作用的多肽。發酵劑是影響干酪抗氧化肽產生的主要因素之一。

不同種屬微生物對抗氧化肽形成產生具有較大影響，抗氧化肽的形成具有菌株特異性[21]，L.delbrueckii subsp.Bulgaricus發酵的酸奶中發現了源自κ-酪蛋白（f96-106）的抗氧化肽Ala-Arg-His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met[22]，L.helveticus和Sac.Cerevisiae發酵的乳飲料中發現了抗氧化肽SKVLPVPQ[23]，不同菌種Mozzarella干酪成熟過程中水溶性肽提取物的抗氧化活性存在差異[9]。分別添加了Lactobacillus casei ssp.casei 30和Lactobacillus paracasei ssp.paracasei 22的Cheddar干酪中的抗氧化肽活性較強[24]。

干酪中添加益生菌能夠進一步增加抗氧化肽。分別添加了干酪乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌等益生菌的Himalayan干酪（Kalari）的水溶性多肽提取物都顯示具有較強的抗氧化活性[20]。益生菌發酵乳桿菌ME-3 Pikantne干酪的水溶性多肽提取物具有較強抗氧化活性[25]。益生菌鼠李糖乳桿菌Cheddar干酪在成熟末，其水溶性多肽提取物對DPPH自由基清除力和還原力分別增加了7.46%和17.58%[26]。加入干酪乳桿菌后，農家干酪中水溶性多肽的抗氧化活性顯著提高[27]。加入了植物乳桿菌和干酪乳桿菌Cheddar干酪的水溶性多肽提取物抗氧化活性也顯著提高[28]。所以，在干酪生產過程中，通過合理優化發酵劑或添加不同特性的益生菌，能夠生產出抗氧化肽含量高和活性強的干酪。

3.2 凝乳酶

酪蛋白的胃蛋白酶產物中發現了具有清除自由基的活性多肽[29]。比較酪蛋白被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶降解后多肽對羥基自由基的清除能力，發現木瓜蛋白酶降解酪蛋白的多肽具有最強抗氧化活性[30]。在添加了凝乳酶、無發酵劑的新鮮山羊乳干酪中也發現了抗氧化肽[31]。動物性凝乳酶（95%凝乳酶和5%牛胃蛋白酶）、植物性凝乳酶（Cynara cardunculus）和微生物性凝乳酶（Mucor miehei）制作的Burgos干酪進行DPPH自由基清除和金屬離子螯合試驗時發現，不同凝乳酶干酪水溶性多肽提取物均具有抗氧化作用，但動物性凝乳酶干酪中抗氧化肽的含量較低[32]。酪蛋白經過不同蛋白酶降解后，能夠單獨產生抗氧化肽。同時，由于不同凝乳酶對酪蛋白酶切位點不同，不同凝乳酶對干酪抗氧化肽積累有較大影響。

3.3 乳源種類

比較不同品種牛乳制作的Caciocavallo干酪的抗氧化活性，發現兩種干酪的水溶性多肽均具有抗氧化性，且意大利黑白花牛乳制作的Caciocavallo干酪的水溶性多肽的抗氧化作用強于意大利棕色牛乳制作的干酪[33]。水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均具有抗氧化性，且水牛乳Cheddar干酪中多肽的抗氧化性較強,兩者對結腸癌細胞產生的自由基均具有抑制作用[34]。駱駝乳發酵產物比荷斯坦牛乳發酵產物具有更強的抗氧化活性[35]。雖然源自不同畜種的乳蛋白具有高度同源性，但是山羊乳、綿羊乳和牛乳間的物化特性不同,導致干酪抗氧化肽的活性出現差異。另外，不同畜種間的乳蛋白基因變化也顯示將會釋放不同結構和功能的生物活性肽[36]。

3.4 成熟條件

干酪生物活性肽的生成，是酶和微生物在適宜溫度下持續作用的結果，因此，成熟條件作為干酪生產中重要的操作單元，對干酪生物活動肽的形成也具有重要影響。4℃、25℃儲藏的H imalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增強，而冷凍儲藏的干酪抗氧性不受影響[37]。對不同成熟階段Cheddar干酪抗氧化性研究發現，成熟4個月之前，干酪抗氧化作用增強，5個月后，干酪抗氧化降低，且在7-9個月的成熟期間，保持不變[24]。但是Songisepp等發現益生菌干酪中抗氧化活性隨成熟時間的延長呈現增加趨勢[25]。

3.5 其它影響因素

干酪是生物學和生物化學動態變化的產品。生產過程中采用的技術如高壓等能影響乳成分，促進生物活性物質的形成和釋放。Quesofresco干酪經真空包裝后，采用高壓處理，發現高壓對干酪水溶性提取物的抗氧化作用有影響，且在壓力400 M Pa，中心溫度40℃，處理20 min時，干酪抗氧化作用最強[15]。Cynara cardunculus蛋白酶制作的未殺菌和殺菌山羊乳和綿羊乳干酪中均發現了抗氧化肽[38]。因此，通過改變生產中的一些工藝條件，能夠增加干酪的抗氧化活性。

4 干酪抗氧化肽特征

乳源性活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次為β-酪蛋白和αS2-酪蛋白，少部分來自κ-酪蛋白[39]。乳酸菌發酵的酸奶中發現了抗氧化肽[40]。抗氧化肽一般由5～16個氨基酸殘基組成[41]。肽的抗氧化性主要與其組成、結構和疏水性有關[42],Tyr、T rp、M et、Lys、Cys和H is是引起多肽具有抗氧化活性的氨基酸[43]，酸奶中抗氧化肽至少含有一個Pro殘基，部分肽N端為疏水性氨基酸如Val、Leu，且肽段序列中含有Pro、H is或Tyr[7]。Parmigiano-Reggiano干酪水溶性肽的抗氧化活性主要與其肽段中的Tyr、M et和T ry有關[4]。

Cheddar干酪中分子量超過10 ku的多肽對DPPH具有較好清除作用[16]，不同凝乳酶干酪中分子量小于3 ku的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白[32]。比較了4℃成熟120 d C rem a de Chiapas干酪中分子量在3～10 ku和小于3 ku的水溶性多肽的抗氧化活性，發現分子量3～10 ku的肽的抗氧性是分子量小于3 ku的多肽的2.5倍[44]。

肽的連接方式和特殊結構特征也影響肽的抗氧化性。Saito曾報道三肽中氨基酸位置的任何改變將導致肽呈現不同抗氧化性[45]。綿羊和山羊乳干酪中發現了源自β-酪蛋白的Tyr-G ln-G lu-Pro-*肽段具有抗氧化活性[38]。添加了附屬發酵劑干酪乳桿菌（Lactobacillus casei ssp.casei 300）的Cheddar干酪中發現了抗氧化作用較強的肽，分別源自β-酪蛋白的VKEAM APK和αs1-酪蛋白的H IQKEDVPSER，其中VKEAM APK的抗氧化作用與商業抗氧化劑BHA相當[3]。Gouda干酪HPIKHQGLPQ水溶性肽分解為HPIL和HGGLPG后抗氧化能力與同劑量的兒茶總素相同[7]。

5 展 望

干酪種類繁多，富含蛋白質，是營養價值高的多功能性食品。由于干酪成熟過程中乳酸菌的存在，干酪為抗氧化肽的產生提供了良好基質。近年來,隨著消費者持續對生活質量提高的關注和高端乳制品的發展趨勢，應進一步探索干酪抗氧化肽的形成機理，分離、鑒定干酪中抗氧化肽，開發出具有抗氧化肽含量高和抗氧化活性強的干酪產品，這對于延緩機體衰老，提高機體抗氧化能力，促進乳制品的換代升級、提升乳品行業的發展水平具有重要積極作用。