藜麥黃酮類(lèi)化合物的提取及測(cè)定方法研究進(jìn)展

付榮霞，周學(xué)永*，李航，崔艷，Rajasab A H

(1.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院， 天津 300384; 2.古爾巴加大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，印度 古爾巴加 585308)

原產(chǎn)于南美洲安第斯高原的藜麥為藜科藜屬的一年生植物[1]。藜麥具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蛋白質(zhì)、淀粉及脂肪含量分別為12.5%～16.7%、58.1%～64.2%和5.5%～8.5%，且含有均衡比例的必需氨基酸[2]、多種維生素、礦物質(zhì)，除此之外，還含有生物活性的功能成分黃酮、皂苷、多酚等[3-5]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織指出藜麥?zhǔn)菍?lái)最具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的農(nóng)作物之一，是最適合人類(lèi)食用、營(yíng)養(yǎng)全面的食物[6]。藜麥的黃酮類(lèi)含量較其他谷物類(lèi)要高，例如，蘆丁、槲皮素、異槲皮素和山奈酚比蕎麥高，其余谷物類(lèi)如大米、玉米等都不含黃酮類(lèi)。在不久的將來(lái)可以將藜麥加工成具有保健功能的調(diào)味品，例如，藜麥醬油、藜麥醋、藜麥蠔油等。黃酮類(lèi)化合物的藥理作用有多種，如降低血壓、降低血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌、防癌等[7-9]，因此，在食品、藥品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，由于黃酮類(lèi)化合物呈現(xiàn)黃色，是良好的天然色素，可用于食品加工業(yè)；提取的總黃酮也可用于制備調(diào)味品[10-12]。由此可見(jiàn)，對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取及測(cè)定方法的探索意義重大。

1 藜麥黃酮類(lèi)化合物提取方法

目前，常用溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取藜麥黃酮類(lèi)化合物。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法依據(jù)的原理是相似相溶，通過(guò)滲透、擴(kuò)散等方式使溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可溶性物質(zhì)溶解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外濃度不同，為了保持溶液的平衡，水分子從濃度低的一方擴(kuò)散到濃度高的一方。選用的提取溶劑要對(duì)黃酮化合物有較大的溶解度，且不與其發(fā)生反應(yīng)，此外，還要考慮溶劑的安全性、是否經(jīng)濟(jì)易得等。最常用于黃酮類(lèi)化合物的提取溶劑為甲醇、乙醇、丙酮和水。溶劑提取法的優(yōu)點(diǎn)是易于操作、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低等，但同時(shí)也有一些缺點(diǎn)，如產(chǎn)率不高、溶劑易殘留、安全性低等。華艷宏等[13]利用超聲波浸提方式，分別選用不同的溶劑(蒸餾水、甲醇、丙酮、乙醇等)研究藜麥種子提取物中總黃酮的含量，結(jié)果顯示：由于溶劑的不同提取得到的藜麥種子總黃酮在1.34～1.98 mg/g范圍內(nèi)變動(dòng)，其中，得到總黃酮較高的溶劑為70%乙醇、蒸餾水，但兩者差異不顯著。孫雪婷等以藜麥種子為材料，采用乙醇回流法提取總黃酮，對(duì)影響提取率的因素進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：影響最大的為料液比，其次為提取時(shí)間，再次為乙醇體積百分?jǐn)?shù)，影響最小的為提取溫度，得到的最優(yōu)提取條件是80%的乙醇，料液比1∶30， 60 ℃提取60 min，采用此工藝條件，得到2.64 mg/g黃酮。

1.2 微波輔助提取法

微波可以轉(zhuǎn)變電磁能為熱能，引起樣品溫度很快增高，在加熱過(guò)程中細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被細(xì)胞內(nèi)液態(tài)水汽沖破，出現(xiàn)微小孔洞，溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞，有效成分被溶解和釋放出來(lái)。微波輔助提取法的特點(diǎn)是選擇性高、溶劑耗量少、節(jié)約能源、受熱均勻，可以較好地保留有效成分，產(chǎn)品提取率高。梁彬等[14]利用微波輔助提取法，以乙醇為溶劑提取藜麥種子總黃酮，對(duì)其影響因素——料液比、微波功率和時(shí)間進(jìn)行探討。結(jié)果顯示：總黃酮的最優(yōu)提取工藝是料液比1∶50，微波功率260 W下提取125 s，平均提取量為6.5 mg/g。

1.3 超聲波輔助提取法

由超聲波引起的震動(dòng)和空化作用可以保持被提取物的結(jié)構(gòu)和生物活性不變，細(xì)胞瞬間破裂，通過(guò)擴(kuò)散作用使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，進(jìn)入溶劑中。超聲波提取易于操作，能夠節(jié)約提取時(shí)間，提高得率。董晶等以藜麥種子為材料，利用超聲波提取黃酮，確定的最優(yōu)條件是：選擇超聲波功率240 W，80%的乙醇，料液比1∶50，50 ℃浸提30 min。董施彬等[16]確定的去皮藜麥種子黃酮提取的最佳條件是：90%的乙醇，料液比1∶10，超聲波提取25 min后， 經(jīng)90 ℃回流提取2 h，得到總黃酮3.861 mg/g。

2 藜麥黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定方法

高效液相色譜法和分光光度法主要用于藜麥黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定，此外，超微弱發(fā)光法可用于黃酮含量的快速檢測(cè)。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜的流動(dòng)相是液體，利用高壓泵輸送洗脫液，使待測(cè)樣品產(chǎn)生移動(dòng)，以致各組分被分離，高靈敏度的檢測(cè)器將其轉(zhuǎn)化成可供檢測(cè)的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)定性定量分析。特點(diǎn)是測(cè)定的樣品范圍廣、效率高、成本低、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確等，但設(shè)備昂貴、流動(dòng)相消耗較多、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。Hirose等測(cè)定了藜麥的黃酮含量(高效液相色譜法)，證實(shí)不同品種間存在較大差別，尤其是槲皮素和山奈酚的含量。熊成文等檢測(cè)了藜麥中槲皮素和山奈酚的含量，選擇甲醇溶液(80%)為提取溶劑，先用超聲波和熱回流提取樣品，之后用濃鹽酸水解，利用高效液相色譜法檢測(cè)水解液中兩種組分的含量。色譜條件：固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為CH3OH-0.4%H3PO4溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，360 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，定量方法為外標(biāo)法。結(jié)果顯示：槲皮素和山奈酚的檢測(cè)范圍分別是0.02～0.40 μg和0.01～0.20 μg時(shí)，線性關(guān)系良好，平均回收率分別是91.0%和89.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是0.7%和4.5%(n=9)。馬麟等[16]利用超聲波輔助提取技術(shù)、反相高效液相色譜檢測(cè)方法研究了藜麥中碳苷黃酮類(lèi)化合物，色譜柱選用Diamonsil-C18，流動(dòng)相為酸性甲醇-水，梯度洗脫，固定流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，同時(shí)檢測(cè)樣品中的葒草素、異葒草素及牡荊素，結(jié)果顯示：精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.2 分光光度法

分光光度法具有標(biāo)準(zhǔn)品容易獲取、易于操作、測(cè)定結(jié)果可靠的特點(diǎn)，是黃酮類(lèi)化合物最常用的定量方法之一。黃酮類(lèi)化合物中的一些分子相對(duì)活躍，能與某些金屬鹽發(fā)生反應(yīng)，得到有色絡(luò)合物，可以通過(guò)光譜檢測(cè)到顏色的變化，因此，測(cè)定黃酮類(lèi)化合物常使用硝酸鋁和氯化鋁等顯色劑。陸敏佳等[17]采用分光光度法測(cè)定藜麥葉片中黃酮類(lèi)化合物的含量，發(fā)現(xiàn)分光光度法雖然易于操作、結(jié)果可靠，但是脂類(lèi)物質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成影響。重復(fù)性試驗(yàn)及回收率試驗(yàn)證明，分光光度法適合測(cè)定總黃酮含量，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。由此可見(jiàn)，藜麥葉片中的脂類(lèi)物質(zhì)含量不影響黃酮類(lèi)化合物的提取和測(cè)定。馮煥琴等選擇乙醇濃度、提取溫度和時(shí)間3個(gè)因素，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)研究藜麥種子總黃酮得率，探討兩種顯色劑(氯化鋁、硝酸鋁)的使用對(duì)總黃酮測(cè)定的影響，結(jié)果表明：使用硝酸鋁作為顯色劑實(shí)驗(yàn)誤差小，結(jié)果穩(wěn)定，可用于測(cè)定藜麥種子中總黃酮的含量。

2.3 超微弱發(fā)光法

黃酮含量的快速檢測(cè)可以利用超微弱發(fā)光法。超微弱發(fā)光是生物生命活動(dòng)的表現(xiàn)形式之一，它能靈敏地反映機(jī)體的生理生化狀態(tài)。黃酮類(lèi)化合物可以阻止自由基鏈反應(yīng)，理論上，種子中黃酮類(lèi)化合物的含量與自由基的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，而后者又與發(fā)射的光子數(shù)量呈正相關(guān)，因此，黃酮類(lèi)化合物的含量應(yīng)該與發(fā)射的光子數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。董艷輝等[18]證實(shí)了藜麥種子中黃酮類(lèi)化合物的含量越高，超微弱發(fā)光值就越低，二者之間呈極顯著負(fù)相關(guān)。常規(guī)育種時(shí)，檢測(cè)藜麥種子中的黃酮含量需要測(cè)定大量樣品，操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間較多，而采用超微弱發(fā)光法檢測(cè)，結(jié)果比較準(zhǔn)確，且檢測(cè)過(guò)程迅速、簡(jiǎn)單，對(duì)種子無(wú)損。因?yàn)槌⑷醢l(fā)光法具有較高的靈敏度，要求較嚴(yán)格的環(huán)境，所以精確度不高，在實(shí)際操作時(shí)各種影響因素都要加以考慮，確保結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)語(yǔ)

藜麥?zhǔn)菭I(yíng)養(yǎng)全面的食品，富含多種生物活性成分，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和極好的保健功能。目前，雖然我國(guó)大量種植藜麥，但對(duì)藜麥生物活性成分的提取和測(cè)定等方面的研究仍處于初步階段，對(duì)藜麥黃酮類(lèi)化合物的提取方法多數(shù)應(yīng)用傳統(tǒng)分離技術(shù)，還需要進(jìn)一步提高提取率，降低提取成本。鑒于藜麥的高潛在利用價(jià)值，對(duì)提取工藝和測(cè)定方法的要求也不斷提高，不僅要有高的提取率、好的產(chǎn)品質(zhì)量，而且測(cè)定方法還要求準(zhǔn)確簡(jiǎn)便、省時(shí)省力。因此，提高藜麥有效成分的提取率，減少有害成分和雜質(zhì)的殘留，減少環(huán)境污染以及發(fā)展聯(lián)用技術(shù)以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)將具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。