DGGE法分析醬菜中酵母菌多樣性

燕平梅,魏愛麗，陳燕飛,趙文婧

(1.太原師范學院 生物系，太原 030619;2.太原師范學院土壤消毒活化 綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

蔬菜醬制這一加工蔬菜的方法在我國由來已久。由于制作方法簡單易學，原料可以直接從當地獲得，因此在我國許多地方形成了獨具風味的產品。醬菜是常見的發酵食品之一，醬菜的生產主要依賴于微生物發酵的工藝。從發酵醬菜的體系中分離出的微生物有細菌、酵母菌和霉菌類等。其中細菌類的代表菌株是胚芽乳酸桿菌、短桿菌，酵母菌類的代表菌株是假絲酵母、醬油酵母，霉菌類的代表菌株是青霉、白地霉等[1,2]。醬菜不僅可以調節口味，還具有促進腸道消化吸收的作用[3，4]。

研究醬菜中酵母菌多樣性的方法有培養法和非培養法。由于培養法在實際操作過程中工作量大且繁瑣，故更多的人選擇非培養法來研究體系中微生物的多樣性。 其中培養法包括磷脂脂肪酸法、生理方法的鑒定系統和分子生物學方法[5]。近年來，分子生態學技術快速發展，受到了廣大科研工作者的喜愛。該技術主要通過分析微生物的基因序列信息研究發酵體系中微生物的多樣性與功能性[6]。其中DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技術更是得到了廣泛的應用。DGGE技術是由Fischer和Lerman率先提出的[7]。1993年，Muyzer等[8]首次將其應用于微生物生態學研究。目前，DGGE技術被廣泛用于環境微生態方面的研究。2015年，趙柏霞等用PCR-DGGE技術研究接種了枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌群落的變化，發現接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌的數量及種類發生了較大變化[9]。呂文洲等[10]的研究結果表明，PCR-DGGE技術用于解析油脂廢水系統中酵母菌群落結構的可行性。張先琴等[11]用PCR-DGGE技術分析了四川地區家庭制作泡菜中微生物的多樣性，結果表明細菌的種類較豐富，而真菌的種類較少。本實驗以兩種市售的醬菜樣品為實驗材料，采用PCR-DGGE技術探究醬菜中酵母菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

3袋袋裝小青瓜(原料∶青瓜)和3袋袋裝醬黃瓜(原料∶青瓜)的混合醬菜，以JA表示；散裝醬菜(原料：黃瓜和青瓜)，以JB表示。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒：索萊寶生物有限公司；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、去離子甲酰、過硫酸銨、尿素(均為分析純)：美國AMRESCO公司；2×Taq Master Mix、DH5a感受態細胞：天根生物技術有限公司；引物：由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器與設備

TC-96(G)H(b)B Life Touch基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；DcodeTM凝膠成像系統、DcodeTM濃度梯度電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 醬菜中微生物基因組DNA的提取

將袋裝醬菜編號為JA，散裝黑色醬菜編號為JB。首先用滅菌濾紙對醬菜汁進行過濾。兩種醬菜汁各取18 mL于9支2 mL的離心管中，8000 r離心5 min。倒盡上清液，收集沉淀，再次離心，倒盡上清液。使用DNA提取試劑盒提取DNA，1%的瓊脂糖凝膠檢測，于-20 ℃保存。

1.3.2 26S rDNA的PCR擴增

在引物合成公司合成擴增所需的上游引物與下游引物。

上游引物為NL1-GC(cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)；

下游引物為LS2(att ccc aaa caa ctc gac tc)。

反應體系:PCR Master 12.5 μL，每種引物1 μL，微生物總DNA 1.5 μL，加ddH2O至25 μL。

1.3.3 PCR產物變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 Formula of denaturing gradient gel

DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應擴增26S rDNA 片段，純化后與pGM-T Vector進行連接， 轉化感受態細胞。將檢測陽性克隆的樣品送到華大基因公司進行基因序列測定。

1.3.4 DGGE圖譜分析

使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜。

計算多樣性指數(H)、均勻度指數(D)、豐富度指數(R)。

計算公式：

多樣性指數(H)[12]的計算公式：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)，E=H/InS，R=S-1/InN。

式中：ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數。

1.3.5 系統發育分析方法

將測序結果提交到NCBI中進行比對，通過MEGA 6.0利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統發育樹。

2 結果及分析

2.1 提取DNA的電泳分析

DNA提取后的電泳檢測結果和PCR擴增產物的電泳圖見圖1。

圖1 基因組DNA(左)及PCR(右)電泳圖Fig.1 Genomic DNA (left) and PCR (right) electrophoretogram

注：JA表示袋裝醬菜，JB表示散裝醬菜，M表示Marker。

由基因組DNA電泳圖1(左)中可知，JA樣品與JB樣品的DNA條帶無非特異帶，能夠進行PCR擴增反應。 由圖1(右)可知，樣品DNA片段大小約為270 bp。擴增產物條帶清晰，因此可以做DGGE實驗。

2.2 變性梯度凝膠電泳結果

PCR擴增產物 DGGE 凝膠電泳分析結果見圖2。

圖2 DGGE 電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoretogram

由DGGE圖譜可知，凝膠圖譜中條帶的位置、粗細以及亮暗程度有一定的差異。JA樣品有3個條帶，分別是JA-2、JA-1、JA-3，表明JA樣品有3種酵母菌。JB樣品有2個條帶，分別是JB-1、JB-2，表明JB樣品有兩種酵母菌。其中JA-1和JB-1、JA-3和JB-2位置一致，表明兩個樣品中有同種酵母菌。JA-2較粗較亮，說明該種酵母菌含量較高。

2.3 醬菜微生物26S rDNA片段的DGGE圖譜分析

2.3.1 醬菜微生物群落結構特征

使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜可知(見表2)，JA樣品與JB樣品的均勻度指數無顯著差異(P>0.05)。JA樣品的多樣性指數和豐富度指數顯著大于JB樣品(P<0.05)，表明JA樣品的酵母菌種類較豐富。

表2 酵母菌微生物群落結構特征Table 2 Structural characteristics of yeast microbial community

2.3.2 醬菜不同發酵時間酵母菌類型的聚類分析

運用Quantity One軟件的“phylogenetic analysis”方式，根據UWPGA算法對兩種醬菜酵母菌群落結構進行相似性聚類分析。由圖3可知，兩種醬菜樣品的酵母菌群落結構聚于一個大分支。

圖3 兩種醬菜26S rDNA 片段的DGGE條帶 相似性聚類圖Fig.3 DGGE band similarity clustering map of 26S rDNA fragments of two kinds of pickles

2.3.3 DGGE回收電泳帶的鑒定

為了研究發酵醬菜體系中優勢的微生物種類，實驗中回收熒光強度強、不同時間差異的電泳帶，通過基因擴增反應后測定堿基序列,與GenBank 庫序列對比鑒定。發酵醬菜樣品DGGE條帶序列結果見表3。

表3 醬菜酵母菌的DGGE條帶序列結果Table 3 DGGE band sequencing results of yeasts in pickles

電泳條帶JA-2、JB-1、JB-2分別與Pichiafermentans(乳源酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)的菌株相似，相似度約為88%、98%、98%。

2.4 系統發育樹分析

使用MEGA 6.0軟件利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統發育樹，對其進行系統發育分析，見圖4。

圖4 醬菜樣品中酵母菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeasts in pickle samples

3 結論

本實驗以兩種市售醬菜為研究對象，通過PCR-DGGE方法分析了這兩種醬菜中酵母菌的多樣性。發現樣品JA比樣品JB的酵母菌種數大，發酵醬菜中的酵母菌總共有3個屬，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)為優勢菌種。兩個樣品的微生物群落結構沒有明顯的差異。2011年，高秀芝等[13]用PCR-DGGE法分析了天源醬園豆醬發酵過程中微生物多樣性。研究表明，發酵過程中主要的細菌優勢種是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和未培養明串珠克隆(UnculturedLeuconostocsp. clone)，主要的真菌優勢種是米曲霉(Aspergillusoryzae)。2014年烏日娜等[14]用PCR-DGGE法分析了東北自然發酵酸菜中的生物多樣性。結果表明，酸菜中的真菌種類比較少，細菌種類較多。主要的真菌菌種有漢遜德巴利(Debaryomyceshansenii)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等。

培養法和非培養法二者都可以用來研究發酵體系微生物的多樣性。培養法是通過配制滿足目的微生物基本生長需求的培養基，使目的微生物在培養基上生長與繁殖的方法，這種方法可能會出現在發酵體系中大量存在的微生物在培養基上無法正常培養或生長的情況，導致研究結果出現偏差。因此更多的人選擇工作量小且能夠較真實地反映發酵體系中微生物多樣性的非培養法[15]，即基于PCR的DGGE技術。2008年， Chang Ho-Won等[16]用PCR-DGGE技術研究細菌、古細菌和酵母在不同類型泡菜中的發酵動力學。根據DGGE的原理，該方法可以分離長度相同但堿基序列不同的DNA片段。 DGGE圖譜中條帶的位置、數量和亮暗程度可以反映出樣品中微生物多樣性的信息[17]。