飼料中黃曲霉毒素檢測研究進展

付 偉，張 偉，陳江魁，王更先

（1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，河北邯鄲 056005； 2.河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用研發中心，河北邯鄲 056005； 3.邯鄲市農業農村局，河北邯鄲 056000）

黃曲霉毒素為半知菌類腐生真菌黃曲霉和曲霉科曲霉屬寄生曲霉的次生代謝產物，目前發現的至少有17 種，如黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1，黃曲霉毒素G2等，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強（李昆等，2017）。黃曲霉毒素的基本結構為二呋喃環和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，即含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在體內的代謝產物。黃曲霉毒素的相對分子量為312 ～346，難溶于水易溶于油，甲醇丙酮和氯仿等有機溶劑，耐熱，在強酸溶液中分解小，強堿溶液中迅速分解。由于黃曲霉和寄生曲霉易感染玉米、大豆等飼料原材料，給飼料加工、生產、保存帶來困難，因此，對飼料中黃曲霉毒素的檢測尤為重要。

1 黃曲霉毒素的來源及對畜禽業的危害

黃曲霉和寄生曲霉廣泛存在于植物、農作物、土壤上，4 ～50 ℃均可生長，但最適宜溫度為25 ～40 ℃，黃曲霉毒素形成的最低溫度為5 ～12℃，最高為45℃，最適溫度為20 ～30℃，因此，黃曲霉毒素廣泛存在堅果、糧食等食品和飼料中。黃曲霉毒素毒性極強，為氰化鉀、砒霜的10、68 倍（李昆等，2017），主要損傷機體肝臟、免 疫 系 統（易 中 華 和 彭 莉，2010 ；LIU 和WU，2010）。同時，黃曲霉毒素是目前已知的最強致癌物質之一，主要誘發腎癌、肝癌、胃癌等（周浮萍和宋詩偉，2017）。黃曲霉毒素在畜牧業的危害主要體現在引起畜禽中毒、引起畜禽飼料轉化率低、免疫功能降低、產蛋量下降、畜禽大量死亡、畜產品中黃曲霉毒素殘留，給養殖業帶來巨大損失的同時對人的健康造成威脅（Pierron A 等，2016 ；Jiang M 等，2015 ；Marin S 等，2013）。黃曲霉毒素對其危害與飼料中黃曲霉毒素含量、飼喂時間及畜禽日齡、體質有密切關系，依據GB13078-2017 國家規定黃曲霉毒素在仔豬、雛禽濃縮料中不超過10 μg/kg，肉用仔鴨后期、生長期濃縮料不超過15 μg/kg，仔豬、雛禽配合飼料15 μg/kg。嚴格按照此標準執行，及時處理霉變飼料，減少黃曲霉毒素對畜禽的危害（熊江林等，2017）。

2 飼料中黃曲霉毒素的檢測方法

隨著科技的進步，黃曲霉毒素的檢測方法越來越多樣化，準確度越來越高，較為常見的黃曲霉毒素檢測方法有基于儀器分析技術、抗體的免疫、適配體生物傳感器及其他方法?；趦x器分析技術檢測黃曲霉毒素的方法主要有高效液相色譜分析法、液相色譜- 串聯質譜分析法，薄層色譜法等（馬騰達等，2019）?；诿庖邔W檢測黃曲霉毒素的方法主要有酶聯免疫吸附測定法、免疫層析法、時間分辨熒光免疫分析法、免疫傳感法（左曉維等，2019）。基于適配體生物傳感器檢測黃曲霉毒素的方法主要有試紙條法、熒光適配體傳感器、聚合酶鏈式反應技術的生物傳感器、電化學適配體傳感器、表面增強拉曼光傳感器等檢測方法（趙穎等，2018）。

2.1 基于儀器分析技術檢測黃曲霉毒素的方法

檢測飼料中黃曲霉毒素最常用的方法之一為基于儀器的檢測技術，如高效液相色譜法，基于儀器分析技術的檢測有重現性好，靈敏度高，定量準確等優點。如鄭會超等（2014）提取青粗飼料，免疫親和柱凈化后，使用高效液相色譜法對飼料中黃曲霉毒素B1、B2等檢測，以甲醇∶水（45 ∶55）為流動相所建立的方法檢出限分別為0.4、0.2 μg/kg，回收率超過80%。黃鑫等（2019）超高效液相色譜- 串聯質譜法檢測飼料中黃曲霉毒素，所建立的方法RSD 小于2.0%，回收率較高。重復性高，準確度較高。陳強勝（2018）按照國標方法及免疫親柱對大米進行處理，使用高效液相方法進行檢測，研究所建立方法的檢測限為0.1 μg/kg，回收率可達到88.95%，靈敏性強，準確率高。

2.2 基于免疫學檢測黃曲霉毒素的方法 隨著科技發展，基于免疫學檢測飼料中黃曲霉毒素的方法越來越廣泛。基于免疫學檢測飼料中黃曲霉毒素技術的原理是以抗體與抗原的特異性結合為基礎的分析方法，其優點是操作簡單、檢測時間段、靈敏度高。姚靜靜等（2019）通過碳二亞胺法制備黃曲霉毒素抗原，并采用體內誘生腹水法制備AFB1單克隆抗體，建立AFB1的酶聯免疫吸附測定方法，其檢測范圍達到0.014 ～1.920 ng/mL，檢測限為0.014 ng/mL，靈敏度較高。任美玲（2015）通過制備量子點熒光微球免疫層析試紙條檢測玉米中黃曲霉毒素發現，所建立的方法其檢測范圍為5 ～60 pg/mL，回收率達到97%～105%，所建方法靈敏度高，可用于檢測。李靜等（2014）通過建立時間分辨熒光免疫層析試紙條檢測黃曲霉毒素發現，其方法回收率可達70%～120%，檢測時間在 15 min 之內，相對誤差較小，同時此方法于LC-MS方法進行比較誤差小于15%。

2.3 基于適配體生物傳感器檢測黃曲霉毒素的方法 適配體生物傳感器檢測黃曲霉毒素的方法關鍵是適配體的制備，適配體是一種具有較強親和力和識別能力的體外合成“化學抗體”（于寒松等，2015），其作用原理是化學抗體與抗原結合。建立方法的靈敏度、準確度取決于所篩選的“化學抗體”與抗原的親和力強弱，分子量大小，結合后結構的穩定性。朱超（2017）試驗制備一種檢測黃曲霉毒素B1的試劑條，并建立了黃曲霉毒素B1熒光適配體檢測方法，其方法檢測限為0.1 ng/mL，穩定性好，檢測范圍較廣，與進口試劑盒比較一致性較好，可用于檢測黃曲霉毒素的檢測。周子明等（2018）通過含有黃曲霉毒素B1的適配體制成試紙條，利用“off-on”光信號增強檢測方法的靈敏度，其檢測限可達50 μg/mL，檢測范圍廣，特異性高，可用于樣品檢測。陳璐（2015）使用熒光素標記適配體，并利用黃曲霉毒素可使適配體結構變化，建立檢測黃曲霉毒素B1和M1的生物傳感器檢測方法，其檢測限為1.6 ng/mL，檢測范圍為5 ～100 ng/mL，加樣回收率高，特異性好。2.4 其他方法 除上述三大類黃曲霉毒素的檢測方法外，仍有多種方法用于飼料中黃曲霉毒素的檢測，如基于金納米簇熒光檢測黃曲霉毒素B1方法，如張瑩瑩等（2018）通過制備金納米簇，利用絡合作用還原使熒光恢復建立了檢測黃曲霉毒素B1的方法，該方法檢測限低為0.1 ng /mL，檢測范圍0.1 ～10 ng/mL，其回收率較高，相對偏差較低；基于藍光光盤技術檢測黃曲霉毒素B1的方法，王海榮等（2018）通過納米技術結合光盤，并在光盤上附著抗體，以檢測黃曲霉毒素，所建立方法檢測最低限度為0.5 ng/mL，檢測范圍為0.5 ～200 ng/mL，檢測范圍較廣，方法靈敏度高、成本較低；基于高光譜特征選擇的黃曲霉毒素檢測方法，殷勇等（2019）通過對霉變玉米黃曲霉毒素光譜特征波長提取，建立霉變玉米中黃曲霉毒素的方法，其結果表明，特征波長下檢測黃曲霉毒素精度較高，且該方法較為穩定可靠。

3 展望

黃曲霉毒素為強毒、強致癌物質可引起畜禽中毒，造成畜禽臟器破壞，大量死亡，對畜禽業的發展影響較大。同時由于黃曲霉毒素亦存在動物乳汁、蛋中，危害人民健康。目前檢測飼料中黃曲霉毒素的方法較多，各有優缺點。如基于儀器分析技術檢測黃曲霉毒素的方法優點是檢測準確度高、重復性強。缺點是前處理過程繁瑣，檢測周期長，檢測成本高，儀器設備昂貴，要專門的檢測人員，大部分需要黃曲霉毒素的標準品，不適合現場操作，推廣性不強。基于免疫學檢測黃曲霉毒素的方法的優點是檢測方法操作簡單、對樣品的純度要求不高、靈敏度高，特異性強，檢測限低、檢測范圍廣、方便攜帶。缺點是由于樣品的前處理過程減少，樣品純度不高，導致檢測結果可能出現假陽性、試劑盒保存時間有限?；谶m配體生物傳感器檢測黃曲霉毒素的方法的優點方便攜帶，穩定，高效，檢測限低，重現性高、成本低。缺點是樣品前處理復雜，步驟多，部分方法重現性較差，“化學抗體”篩選較為費時。針對不同的樣品采用不同的檢測方法，如樣品若需要準確定量、重復性好時可選用基于儀器分析技術檢測黃曲霉毒素；若樣品需要快速檢測，對定量要求不高時可使用基于免疫學檢測黃曲霉毒素的方法。同時操作簡單、數據準確可靠、重復性強、靈敏度高、所需儀器不貴重，不出現假陽性新的檢測方法的探索和建立對飼料檢測和畜禽業的發展有重要意義。