醬油釀造用產香酵母的選育研究進展

杜雯,王中偉，孟凡冰,，李云成,*，劉達玉,，余華，彭鐮心

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106；2.農業(yè)農村部雜糧加工重點實驗室，成都 610106)

醬油是一種以大豆、小麥或麩皮為原料釀造的一種具有獨特醬香且營養(yǎng)豐富的調味品。醬油的釀造工藝主要分為低鹽固態(tài)發(fā)酵法和高鹽稀態(tài)發(fā)酵法兩種[1]。在醬油的發(fā)酵成熟過程中，蛋白質、淀粉等的簡單分解及有機成分間復雜的酶解與合成過程，產生大量的小分子化合物，構成醬油的風味[2]。除此之外，風味物質的產生還與醬醪中的微生物活動息息相關，酵母菌直接或間接地參與了醬油中的酒精發(fā)酵、酸類發(fā)酵和酯化作用等[3]，通過代謝組學對低分子量代謝產物的綜合研究發(fā)現(xiàn)，這些反應既可減少醬油中的一些不良風味，又可促進醬油風味更加豐富和柔和[4]。此外，某些酵母菌的發(fā)酵作用對4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)、4-乙基苯酚、2-乙基-4-羥基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)等醬油特征性風味物質的積累有重要影響[5]。然而，酵母菌在醬油高鹽釀造過程中生長緩慢或不能生長，因此能夠選育出高耐受性(耐鹽、耐溫、耐酸)的酵母菌株對醬油品質的提高有重要意義。

1 醬油釀造產香酵母的種類

目前，醬醅中可分離出7個屬，32個種的酵母菌，工業(yè)上用于醬油發(fā)酵的酵母菌主要包括作為主發(fā)酵酵母的魯氏酵母和賦予醬油特定香氣成分的球擬酵母(也稱后發(fā)酵酵母)，也有部分假絲酵母可作為后發(fā)酵酵母運用于醬油生產中[6,7]。

1.1 魯氏酵母

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)具有良好的耐鹽性能，在18%食鹽濃度下仍能生長，在24%食鹽濃度下生長弱，向醬醪中添加VB5、VB7、肌醇、膽堿能夠促進魯氏酵母在高食鹽濃度下生長[8]。在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中魯氏酵母作為主發(fā)酵酵母進行酒精發(fā)酵作用，通過糖酵解途徑(EMP途徑)生成乙醇，也可同釀酒酵母一樣通過埃利希途徑利用不同支鏈氨基酸合成相對應的芳香雜醇如異戊醇、活性戊醇、異丁醇等[9]。郭建等[10]接種魯氏酵母CICC1417后能顯著提高醬醪中的HEMF含量。Meng等[11]研究表明，魯氏酵母發(fā)酵能夠產生2-呋喃甲硫醇和2-巰基丙酸乙酯，其對日系醬油的風味有著重要作用。另外，隨著發(fā)酵溫度的升高，魯氏酵母自溶促進了后熟酵母如易變圓酵母、多變假絲酵母、球擬酵母等的生長代謝，產生4-EG、4-乙基酚、HEMF等香味物質[12,13]。

1.2 球擬酵母

球擬酵母也是一種在高滲透壓下仍能生長的耐鹽性酵母，屬于后發(fā)酵酵母，起產酯增香的作用，主要形成4-乙基苯酚(4-EP)、4-EG和2-苯乙醇等香氣成分，同時酵母菌體在發(fā)酵后期發(fā)生自溶，呈鮮味的核酸類物質的含量增加[14]。在醬油中添加球擬酵母可相對縮短生產周期，有效提高醬油品質。球擬酵母還可產生酸性蛋白酶，在發(fā)酵后期對未分解的肽鏈進一步水解，提高醬油的鮮味。醬油發(fā)酵常用的球擬酵母主要有三類：易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)、埃契氏球擬酵母(Torulopsisetchellsii)和蒙奇球擬酵母(Torulopsismogii)[15]。酈平爾等[16]在采用瀘釀2.14球擬酵母改善低鹽固態(tài)淋澆發(fā)酵的醬油品質實驗中，得出最佳發(fā)酵工藝參數是在發(fā)酵21 d時添加1.4%的球擬酵母，并調節(jié)發(fā)酵溫度至32 ℃，其醬油氨基酸態(tài)氮含量平均值為1.43 g/dL，與預測值(1.44 g/dL)偏差小于2%，具有較好的實踐指導意義。

1.3 假絲酵母

假絲酵母(Candidaversatilis)是一類發(fā)酵能力較弱的酵母，有氧條件下能夠生長繁殖，無氧條件下能夠發(fā)酵乙醇。假絲酵母自身能夠合成甘油，同時還能從環(huán)境中吸收甘油，因此具有很高的耐鹽性，在高鹽條件下能發(fā)酵麥芽糖生成乙醇，同時還能產生酚類化合物，如賦予醬油丁香香味和煙熏味的4-EG和4-乙基酚等。曹小紅等[17]研究耐鹽酵母添加對高鹽稀態(tài)醬醪風味成分的影響時表明，在醬醪發(fā)酵第45天時添加假絲酵母可以提高醬油中主要酯類、醇類及醛類的含量且HEMF的含量也可明顯提高。Feng等采用兩步醬油接種法向高鹽稀態(tài)醬油中接種假絲酵母，可有效提高醬油的氨基酸態(tài)氮、無鹽固形物及揮發(fā)性風味成分。

2 醬油釀造產香酵母的選育技術

目前存在的天然酵母抗逆性差，耐鹽、耐酸、耐高溫性能差，因此需要通過選育得到性狀穩(wěn)定、耐性較好的菌株。食品微生物育種的方式主要有誘變育種、基因組重排等；近年來，原生質體融合技術也在不斷發(fā)展，逐漸得到廣泛應用；進化工程選育作為一種新興的選育技術也在逐步應用于微生物的選育中。

2.1 誘變育種

誘變育種是指運用物理或化學的方式，誘導微生物的遺傳特性發(fā)生變異，再從變異的群體中選擇符合人們某種要求的單株菌體，進而培育成為新的品種的育種方式。誘變育種具有操作簡單、易重復、操作過程不會引入外源基因等優(yōu)勢，保證了食品的安全性，因而廣泛應用于食品微生物的選育中[18]。

物理誘變利用紫外線、X射線、α射線、β射線、γ射線、激光、微波、離子注入等物理方式提高生物的自然突變率。其中，紫外誘變因其危險性低、設備簡單成為實驗室最常用的物理誘變手段?；瘜W誘變是利用一些化學誘變劑(烷化劑、堿基類似物、嵌入劑、某些無機化合物等)來提高生物的自然突變率的育種方式。常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝基胍(NTG)；常用的堿基類似物有6-嗅尿嘧啶、馬來酰肼、2-氨基嘌呤等；常用的嵌入劑有溴化乙錠(EB)，可嵌入堿基分子中導致錯配；常用的無機化合物主要有氯化鋰、亞硝酸鹽、過氧化氫等[19]。Tekarslansahin等[20]通過EMS誘變獲得耐鹽釀酒酵母菌株，鹽濃度最高可達8.5%。有時單一的突變方式并不能得到我們想要的性狀，宋茜[21]將經過紫外照射與EMS誘變處理后高鹽平板篩選得到的突變群體作為出發(fā)菌株，結合基因組重排和高鹽培養(yǎng)基篩選，得到的菌株H3-8耐鹽性由12%提高到20%，并且大量產生乙醇、乙酸乙酯等風味物質。

總的來說,誘變育種在操作上方便，對設備要求低，可行性高，但是存在變異方向不受控等缺陷，因此提高誘變效率，迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑，是當前研究的重要課題。

2.2 原生質體融合

原生質體融合，又稱為細胞融合，指通過人為的方法將兩個或兩個以上遺傳性狀不同的細胞原生質體進行接觸，使得發(fā)生細胞質和細胞膜融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的方法[22]。原生質體融合的過程一般分為原生質體的形成、原生質體的融合、原生質體的再生與選擇3個階段。Lee等[23]在3.0%的EMS中通過營養(yǎng)補充的方法篩選出魯氏酵母ZRM-83和釀酒酵母SCM-46的營養(yǎng)缺陷性突變型菌株魯氏酵母M-12和釀酒酵母M-43，發(fā)現(xiàn)在0.05 mg/mL的消解酶中培養(yǎng)60 min后，兩個兩種菌株的原生質體融合效果更好，用20%聚乙二醇6000處理30 min后融合效率和融合頻率均顯著提高，且這些來源于兩種原生質體的融合子具有細胞大、DNA含量高的特性。

相對于常規(guī)的誘變育種，原生質體融合技術用于微生物育種的目的性強，成功的機率較大，單親滅活原生質體融合法大大提高了篩選的效率。由于它所具有的受接合型的限制較小、遺傳物質更加完整、雜交頻率高等一系列特點，原生質體融合技術越來越被國內外酵母選育專家和其他微生物育種學者廣泛研究和應用。

2.3 Genome Shuffling技術

基因組重排首先通過傳統(tǒng)誘變方法對性狀優(yōu)良的出發(fā)菌株進行誘變，通過誘變來篩選不同優(yōu)良正突變的菌株建立突變體庫，然后將這些突變體的基因通過原生質體融合技術發(fā)生隨機重組融合，經過多輪遞推原生質體融合，眾多優(yōu)良性狀的基因就可以集中在同一菌株，因此可高效率、快速地篩選到性狀得到較大提升的融合菌株[24]。王春玲等[25]通過基因組改組從釀酒酵母AS21182中獲得的S3-4菌株耐鹽性從100 g/L提高到180 g/L，且乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇和乙酸等物質的含量均得到有效提高。Cao等[26]經過三輪基因組重組，從醬油魯氏酵母中篩選出一株抗鹽性較強的突變體S3-2，此突變體加速了醬油風味的形成時間，經檢測，乙酸乙酯含量是對照組的2.38倍，HEMF含量提高了75%，基因組重組法成功改善醬油風味。Cao等[27]也對異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)中一株耐鹽性較強的突變株H3-8進行了三輪基因組重組篩選，結果表明H3-8可以在含鹽量17%的YPD培養(yǎng)基中生長，且能在較寬的pH范圍內生長，此外，H3-8中的HEMF產量是魯氏酵母的6.3倍，由H3-8生產的乙酸乙酯是易變球擬酵母的734倍。4-EG的產量比易變球擬酵母的增加了10.84%。

經基因組重排改造后的酵母菌株可有效提高產物產量以及對環(huán)境的耐受性，改善底物的利用率和范圍，產生新的代謝產物或提高酵母遺傳多樣性，且可穩(wěn)定遺傳。在未來，基因組重排將會推動酵母菌株育種工程的發(fā)展，優(yōu)良性狀的酵母菌種將會在食品釀造領域獲得廣泛的應用前景。

2.4 進化工程選育

進化工程(evolutional engineering)是為了獲得某個既定表型菌株，在人工提供選擇壓力的條件下通過模擬自然進化中的生物變異和選擇過程使微生物進化，然后從進化的菌群中篩選出性狀優(yōu)良的菌株的方法[28]。目前進化工程在工業(yè)酵母的選育上研究較多，研究者不僅能夠通過進化工程得到性能有所提高的表現(xiàn)型菌株，同時在關鍵酶作用和代謝途徑的研究方面取得了一定的進展[29]。利用醬油釀造的環(huán)境壓力(如食鹽濃度、pH、溫度等)加速目標菌株產生適應性進化，大大提高了菌株的抗逆性，因此其在耐鹽性、耐酸性和耐溫性產香酵母的選育方面具有很好的應用前景。馮杰采用批次馴化的方法將埃切假絲酵母的耐鹽濃度從180 g/L提高到240 g/L，且能明顯提高醬油中HEMF、4-羥基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)和4-EG等關鍵風味化合物質含量，顯著改善醬油的風味品質。在菌種選育過程中，進化工程還可以與誘變育種相結合，通過誘變產生大量的突變文庫，然后利用外加壓力進行選擇性篩選，把負向突變或目標性狀較弱的突變體加以淘汰，增加正向突變的篩選成功率[30]。然而，目前關于產香酵母的進化工程選育的研究報道還很少，但相信未來該方法會在醬油產香酵母選育領域加以利用。

3 小結與展望

總的來說，近年來有關醬油產香酵母菌的選育研究越來越受到重視。目前產香酵母的選育多采用誘變育種的方式來進行特定性狀菌株的選育，雖然此方法對設備要求低、方便、易操作，但是突變方向往往不確定，因此需要利用更好的技術來實現(xiàn)菌株性能的定向改變。原生質體融合、基因組重排以及進化工程的方法在工業(yè)釀酒酵母的選育中有著較為廣泛的應用，但是在醬油發(fā)酵產香酵母的選育研究中還相對較少，技術尚不成熟。因此，在今后的研究中可加大技術開發(fā)力度，通過這些技術實現(xiàn)產香酵母中香味物質的大量積累。同時，還需加大基礎研究，深入探究產香酵母風味物質的產生機理，為實現(xiàn)產香酵母合理代謝工程(rational engineering)改造奠定基礎。