米諾環素對腦缺血再灌注后大鼠細胞凋亡的影響

熊建忠 易 飛 揭文環 (萍鄉市人民醫院神經內科，江西 萍鄉 337000)

米諾環素對腦缺血再灌注后大鼠細胞凋亡的影響

熊建忠 易 飛 揭文環 (萍鄉市人民醫院神經內科，江西 萍鄉 337000)

目的 觀察米諾環素對腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響。方法 30只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、生理鹽水組、預處理組、30 min組、4 h組，每組6只。采用線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注模型。用RT-PCR、免疫組化、Hoechst染色、核磁共T2WI成像等方法，了解米諾環素對缺血后細胞凋亡的影響。結果 腦缺血后caspase-3、ICE表達增強，半暗帶區凋亡細胞增多，T2WI掃描在缺血側可見大片異常信號區。預處理組、30 min、4 h組caspase-3、ICE表達減少，細胞凋亡百分率下降，腦缺血體積縮小。結論 米諾環素能減輕缺血后細胞凋亡。

腦缺血再灌注;米諾環素;凋亡

腦缺血嚴重危害著人類生命和健康，其病理機制十分復雜。細胞凋亡在腦缺血損傷中發揮著重要的作用。在缺血性腦損害中，壞死主要發生在缺血中心，而凋亡多位于半暗帶，是一種遲發的神經元死亡。神經元凋亡是一種由基因控制的細胞主動死亡過程，在不同的刺激信號的影響下，涉及多個基因表達及相互作用的復雜過程。本文將從凋亡調節蛋白酶ICE、caspase-3及Hoechst染色及腦細胞缺血體積等方面，研究米諾環素對腦缺血再灌注損傷后凋亡的影響，及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器

微鏡：日本Nikon公司。ICERT-PCR試劑盒：上海生物工程技術有限公司;Hoechest33258染色液：上海碧云天生物技術公司;caspase-3抗體：廣州森達生物技術公司。米諾環素：中國惠式制藥公司。

1.2 實驗分組

雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，中南大學動物實驗中心提供。實驗分為5組：假手術組(術后30 min腹腔注射米諾環素45 mg/kg)，生理鹽水組(腦缺血后30 min腹腔注射等量的生理鹽水)，預處理組(腦缺血前12 h腹腔注射米諾環素45 mg/kg)，30 min組(腦缺血后30 min腹腔注射米諾環素45 mg/kg)，4 h組(腦缺血后4 h腹腔注射米諾環素45 mg/kg)。

1.3 腦缺血再灌注模型的制作

血再灌注模型。大鼠用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，頸部正中切口，鈍性分離，暴露右頸總、頸內和頸外動脈，結扎頸外動脈和頸總動脈。在頸總動脈分叉處剪一小口，沿頸內動脈向顱內插入魚線(18.5±1.5)mm。栓塞90 min后將魚線拔出。假手術組魚線插入深度為10 cm，余步驟相同。

1.4 取材和免疫組化染色

大鼠缺血再灌注24 h后，用10%的水合氯醛麻醉，等滲生理鹽水和4%多聚甲醛PBS液進行心臟灌注，斷頭取腦，取距嗅球尖端7～11 mm間的腦組織塊，置于4%多聚甲醛中固定，脫水，包埋，連續切片，片厚6 μm。免疫組織組化染色嚴格按照說明書進行。

1.5 Hoechst染色

切片常規脫蠟透明后，置于六孔板上以0.9%生理鹽水洗3遍，每次3 min，吸盡液體，然后加入0.5 ml的Hoechst染色液，手搖晃動以充分染色，染色5 min，完成后將切片置于載玻片上，滴上1滴抗淬滅液，蓋上潔凈的蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察神經細胞凋亡形態并進行拍照。

1.6 核磁共振掃描

采用美國GE 1.5 T超導MRI成像設備，3英寸表面線圈為接收線圈。大鼠腦缺血再灌注24 h后行T2WI掃描。將麻醉的大鼠俯臥位，頭部置于線圈中央。先掃描定位像，自嗅溝水平向尾側作連續冠狀位掃描。掃描參數：T2WI：TR/TE/NEX 4200/15.7/6，層厚3 mm，層間隔0 mm，FOV 8 cm×8 cm。MRI原始數據傳入工作站，病變和腦半球體積測量由同一名影像專業醫師在同一天完成。

1.7 結果分析

caspase-3陽性細胞判斷標準：細胞質染成棕黃色，部分核著色。每張切片選取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析光密度值。細胞凋亡百分率：切片Hoechst染色后在熒光顯微鏡下觀察，并攝片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，計算出細胞凋亡百分率。腦缺血體積的測量：將圖像放大并優化窗寬窗位后，運行體積分析軟件，計算各層數

以Longa改良法制備大鼠缺

1.5T核磁共振：美國GE公司;熒光顯據與層厚的積，累加得到體積。測量缺血同側半球體積(HVi)、對側半球體積(HVc)和病變體積(LV)，求得校正后缺血病變體積比=(HVc-HVi+LV)/HVc×100%。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 casepase-3免疫組化表達

免疫組化結果顯示：caspase-3陽性細胞主要位于梗死灶邊緣。假手術組可見少量casepase-3陽性細胞。生理鹽水組缺血灶周圍可見大量caspase-3染色陽性細胞。與假手術組相比，其平均光密度值增高，差別有顯著性意義。與生理鹽水組相比，預處理組、30 min組、4 h組平均光密度值下降(P＜0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠的caspase-3光密度值及細胞凋亡百分率(s)

表1 各組大鼠的caspase-3光密度值及細胞凋亡百分率(s)

為各組與生理鹽水組相比：1)P＜0.01

組別 n 細胞凋亡百分率(%) caspase-3光密度值生理鹽水組6 4.733±3.095 0.436±0.081假手術組 6 27.900±7.4391) 0.174±0.0391)預處理組 6 13.200±5.1021) 0.304±0.0851)30 min組 6 12.700±4.3881) 0.289±0.0831)4 h組 6 15.667±6.3701) 0.343±0.0941)

2.2 Hoechst 染色結果

在熒光顯微鏡下正常細胞發出的熒光較微弱，凋亡細胞的細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒凝塊熒光及明顯核形態變化，發出強亮的熒光。假手術組大腦皮層只有少量凋亡細胞，生理鹽水組在腦缺血灶周圍中可見大量凋亡細胞，與假手術組相比，差別有顯著性意義(P＜0.05，P＜0.01)。預處理組、30 min、4 h組細胞凋亡百分率下降，與生理鹽水組相比差別有顯著性意義。見表1、圖1。

2.3 核磁共振T2WI成像

假手術組核磁共振T2WI掃描，無異常信號。生理鹽水組T2WI掃描在缺血側可見大片高信號區。與生理鹽水組相比，預處理組、30 min、4 h組相對腦缺血體積減少，差別有統計學意義。見表2、圖1。

2.4 ICE的表達

達，生理鹽水組在缺血半暗帶ICE表達增強，與假手術組相比，差別有統計學意義。預處理組、30 min、4 h組ICE的表達降低，與生理鹽水組相比，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表 2、圖 2。

假手術組大鼠的大腦皮層只有少量ICE表

表2 各組大鼠相對腦缺血體積及ICE O/D值±s)

表2 各組大鼠相對腦缺血體積及ICE O/D值±s)

與生理鹽水組相比：1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 腦缺血體積(%) 的表達(O/D值)生理鹽水組6 28.568±5.180 1.478±0.460假手術組 6 0.000±0.0002) 0.214±0.0641)預處理組 6 15.465±3.5081) 0.426±0.1441)30 min組 6 16.358±3.7531) 0.463±0.1531)4 h組 6 17.102±2.6371) 0.485±0.1351)

圖1 生理鹽水組caspase-3免疫組化染色、hoechst染色、T2WI成像

圖2 各組ICE mRNA表達

3 討論

ICE是caspase家族中最早克隆的凋亡相關基因。ICE能使IL-1β前體轉化成為成熟形式，ICE對腦缺血凋亡的調節是通過IL-1β發揮作用〔1〕。成熟的 IL-1β促進凋亡的發生，是凋亡的增強因子〔2〕。caspase-3是caspase級聯反應中最關鍵的蛋白酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路〔3〕。活化的caspase-3可裂解多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，DNA的損傷不能正常修復，引起核固縮，DNA裂解，凋亡小體形成。

Hoechst染色后在熒光顯微鏡下能迅速區分出正常細胞與凋亡細胞，被廣泛地用于細胞凋亡研究。腦缺血后腦梗死體積是腦卒中實驗研究中的一個重要預后參數，而且與細胞凋亡密切相關。而MRI是一種可與其他方法兼容的、可重復性完成活體測量的方法。米諾環素是一種半合成的第二代四環素衍生物，它可順利通過血腦屏障，在中樞神經系統米諾環素可以達到有效的臨床治療藥物濃度水平〔4〕。近來動物模型研究發現米諾環素具有抗微生物特性外，還具有抑制炎癥反應、細胞凋亡等作用。

本實驗結果顯示：腦缺血再灌注損傷后24 h，缺血半暗帶區caspase-3、ICE表達明顯增強，凋亡細胞增多。T2WI檢測可見缺血側大片高信號強度區。在大鼠腦缺血前12 h，缺血后30 min，甚至在腦缺血后4 h給大鼠腹腔注射米諾環素(45 mg/kg)能明顯降低腦缺血后caspase-3、ICE的表達，細胞凋亡百分率及腦缺血體積。本試驗結果進一步證實米諾環素在腦缺血前后一定時間段給藥具有抗細胞凋亡作用，與Arvin等〔5〕研究結果相一致。

米諾環素的抗凋亡作用可能與阻止細胞內Ca2+超載、細胞色素C和Smac/Diablo的釋放，縮小線粒體的皺縮和腫脹，抑制線粒體的死亡有關。同時米諾環素還能抑制ICE和caspase-3的表達及ICE和caspase-3的活性;另外，米諾環素還能抑制小膠質細胞激活，穩定線粒體膜，減少線粒體對Cyt-C，Smac/Diablo和 AIF 的通透性〔6〕，上調抗凋亡因子 bcl-2〔7〕。米諾環素可以通過JNK通路抑制神經元的凋亡。米諾環素能還通過抑制缺血后COX-2、前列腺環素E2等的表達減少自由基的產生，達到抑制細胞凋亡的作用。米諾環素可通過caspase途徑和非caspase 途徑抑制缺血后細胞凋亡〔8，9〕。

綜上所述，米諾環素能減輕腦缺血再灌注損傷所引起的細胞凋亡。米諾環素作為一種新型抗生素，具有高親脂性，有極好的組織滲透性，能廣泛分布于身體各組織及體液中，故被廣泛地用于臨床，且長期大劑量使用，被證明是安全的。故米諾環素有望作為新的腦保護藥在防治腦梗死中發揮作用。但目前對米諾環素的研究大多停留在動物實驗階段，其臨床效果還需要更多的實驗加于證實。

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Effect of minocycline on neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion rats

XIONG Jian-Zhong，YI Fei，JIE Wen-Huan.
Department of Neurology，the People's Hospital of Pingxiang，Pingxiang 33700，Jiangxi，China

Objective To explore the effect of minocycline on the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods 30 healthy male SD rats were randomly divided into sham，control，minocycline preconditioning，30 min，4 hour groups(n=6).Middle cerebral artery occlusion in rats was established with the suture method.Minocycline on the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats was detected with immunohistochemistry，reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，Hoechst stain and T2WI.Results Lots of caspase-3 protein positive cells were seen in the area adjacent to ischemia and the expression of the interleukin-1β converting enzyme(ICE)was increased significantly in control group.Apoptotic cells were increased significantly in control group.There were large abnormal signal areas in control group when cerebral ischemic areas were visualized with T2-weighted.The relative infarction volumes was decreased，the expressions of the ICE and caspase-3 also were decreased in minocycline preconditioning，30 min and 4 hour groups.In those groups minocycline was treated at 12 h before ischemia and 30 min，4 h after the onset of ischemia，the rate of apoptotic cells was significant lower than that of control group.Conclusions Minocycline could ameliorate the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion.

Cerebral ischemia-reperfusion;Minocycline;Apoptosis

R749

A

1005-9202(2012)23-5203-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.046

江西省科技計劃支撐項目(No.SB01800)

熊建忠(1974-)，男，副主任醫師，博士，主要從事腦血管疾病研究。

〔2011-07-25收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢園)