供體特異性調節性T細胞在肝移植免疫耐受中的意義

王凱，高偉

作為治療各種終末期肝病的有效手段，肝移植的存活率大幅提高，但術后仍面臨慢性排斥反應、長期使用免疫抑制劑帶來的腎功能損害、感染、腫瘤、代謝并發癥等風險。誘導移植術后免疫耐受是解決這一問題的根本方法。肝臟作為免疫特惠器官，較其他臟器更容易實現免疫耐受。器官移植術后主動誘導免疫耐受的方案主要包括聯合骨髓移植誘導同種異基因嵌合體、受者術前T淋巴細胞清除、阻斷共刺激通路、過繼輸注免疫抑制細胞等［1］。其中，調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）由于其免疫抑制特性成為研究的熱點，但常規Treg在作用時效、作用部位、多克隆Treg 細胞的遷移等方面均存在一定的局限性［2］。研究認為，供體特異性調節性T細胞（donor specific regulatory T cell，DSTreg）可誘導移植術后受者產生針對供體抗原的特異性耐受，不服用免疫抑制劑而長期維持移植物功能正常［3］。而胸腺移植是產生并維持DSTreg細胞長期生存的有效途徑［4］。現就DSTreg 細胞在免疫耐受中的作用與意義進行綜述。

1 Treg細胞的特性及其在排斥反應中的作用

Treg細胞是一類具有強大免疫抑制功能的T細胞亞群，其特性主要是免疫低反應性和免疫抑制。Treg細胞的免疫抑制作用是維持機體穩態的重要因素之一，其表達異常可引起多種自身免疫性疾病。Treg 細胞主要在胸腺與外周淋巴器官中發育，通常將其分為兩類，即胸腺來源的Treg細胞（nature Treg，nTreg）與在外周誘導生成的Treg細胞（induced Treg，iTreg）。nTreg 細胞與iTreg 細胞在功能上存在一定的差異，前者被認為是免疫抑制能力較強的Treg 細胞亞群，在體內維持免疫耐受中起根本性作用［5-6］，而iTreg細胞在外周誘導產生后功能受損，會失去調節免疫耐受的能力［7］。叉頭翼狀螺旋轉錄因子（forkhead/winged helix transcription factor p3，Foxp3）是CD4+Treg 細胞分化、發育、保持功能穩定的重要因子，也是其最重要的鑒別標志物。小鼠中區分nTreg 和iTreg 的標志物是神經纖毛蛋白1（neuropilin-1，Nrp1）［8］，而在人體內則是Treg細胞特異性脫甲基區域（treg-specific demethylated region，TSDR）［9］。

Treg細胞與移植后排斥反應密切相關。研究顯示，兒童肝移植患者在發生急性排斥反應時，外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例降低，在抗排斥治療后進一步下降，1 周后仍不能恢復正常［10］。其在成人患者中亦有相似表達，且伴有Treg 細胞相關細胞因子的變化［11］。Zhou 等［12］利用大鼠肝移植模型發現，急性排斥反應中Treg 細胞及其相應細胞因子白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）顯著降低。

2 Treg細胞誘導移植術后免疫耐受

基于Treg 細胞的免疫抑制特性，其抑制排斥反應、誘導免疫耐受的作用相繼被證實。研究顯示，在停用免疫抑制劑5年以上的肝移植患者中，移植肝組織中 Treg 細胞比例明顯增加［13］。Chandran 等［14］將Treg 細胞在體外培養、擴增后輸注于腎移植患者體內，輸注過程安全，在降低免疫抑制劑的情況下，移植物僅存在輕度的炎癥反應。但后續的研究表明，多克隆Treg細胞誘導免疫耐受亦存在較多問題。細胞過繼輸注中所需的Treg 細胞數量巨大，而培養后的Treg細胞純度低且穩定性差、體內存活期短，輸注后還可導致受體免疫受限，進而引發感染［15-16］。另有研究通過小鼠肝移植模型推算，小鼠體內的Treg 細胞至少要增加33%才可達到預期的治療效果［17］。在一項臍帶血Treg細胞預防移植物抗宿主病的研究中，輸注的Treg細胞在體內很快衰竭，半衰期大約在20 d 左右，且Treg 細胞衰減的程度與輸注的劑量無關［18］。同時，Treg 細胞也受免疫抑制藥物的影響，這也進一步限制了其臨床應用。在成人肝移植患者中，他克莫司對Treg 細胞存在明顯的抑制作用，且這種作用與他克莫司濃度有關，高濃度他克莫司對 Treg 細胞的抑制作用更強［19］。針對 Treg 細胞在免疫誘導中存在的諸多不足，研究者相繼采取了很多方法以提高Treg 細胞的分化比例，穩定擴增后的表型與抑制功能。Hajkova等［20］研究發現，在細胞培養中加用雷帕霉素可以顯著提升體外培養體系中Foxp3的表達水平。另有研究認為，增加TGF-β、IL-2 等細胞因子可以促進Treg 細胞的分化、修復其調節功能［21］；使用骨髓間充質干細胞還可以誘導幼稚T細胞向Treg細胞分化［22］。盡管上述方案可以在很大程度上增強Treg 細胞的分化與功能，但缺乏對供體抗原的特異性抑制，從而使其數量仍無法達到有效誘導免疫耐受的目的。因此，有研究認為只有足夠數量的Treg細胞到達移植物和局部淋巴結等炎癥反應部位，才可有效抑制效應細胞的作用［23］。

3 DSTreg細胞具有更強的免疫抑制功能

DSTreg 細胞可以特異性作用于供體效應細胞，僅用少量的細胞就可以達到抑制排斥反應、誘導免疫耐受的目的。在實體器官移植中已經證實，DSTreg 細胞比多克隆Treg 細胞在抗排斥反應中更有潛力［24］。在小鼠心臟移植模型中發現，持續使用西羅莫司、環孢霉素、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associat-ed antigen 4，CTLA4-Ig）等藥物并不會促進DSTreg 細胞的擴增，只是抑制常規T 細胞的擴增，而排斥或耐受的效果與移植物中積聚的DSTreg 細胞的比例有關［25］。Todo等［26］在CD80/CD86單克隆抗體存在的情況下，將成人親體肝移植受者的淋巴細胞與經過照射的供者細胞進行共培養，產生DSTreg 細胞，在肝移植術后早期將培養后的細胞輸注至受者體內誘導免疫耐受，隨訪16～33個月，10例患者中7例完全停用免疫抑制劑，其中4例停藥超過24個月。

獲得DSTreg細胞的傳統方法是在伴有T細胞受體（T cell receptor，TCR）的環境下，將Treg 細胞與抗原呈遞細胞、特定抗原一起培養。Mathew等［27］利用可溶性CD40L激活供體B細胞與受者Treg細胞共培養，得到了純度較高的 DSTreg 細胞。Monti 等［28］認為雷帕霉素不僅對常規Treg 細胞有促進作用，而且可以促進 DSTreg 細胞的增殖。Ratnasothy 等［29］研究發現，IL-2可明顯提高DSTreg細胞抑制排斥反應的效果，延長移植物存活時間。不僅如此，耐受模型中提取的DSTreg 細胞在輸注給同種移植受體后亦具備特異性免疫抑制功能［30-31］。然而，Kotsiou 等［32］研究認為，DSTreg 細胞在培養擴增后表型與抑制功能不變，但會喪失部分趨化功能。因此，利用這些方法得到的供體抗原特異性Treg 細胞在體外擴增后，大部分會失去抗原特異性，作用有限。

4 T細胞受體的Treg細胞（T cell receptor Treg，TCR-Treg）與嵌合抗原受體Treg細胞（chimeric antigen receptor Treg，CAR-Treg）

為了克服傳統培養的DSTreg 細胞的不足，利用基因工程技術，通過結合TCR產生的TCR-Treg細胞可以更好地維持抗原特異性功能［33］。TCR信號對于Treg 細胞的產生、分化、抑制功能非常關鍵，Treg 發揮抑制功能主要依賴于TCR接觸［34］。Savage等［35］利用供者B細胞激活受者Treg細胞，再結合TCR，輸注于腎移植聯合骨髓移植的患者，利用TCR-Treg細胞在體內增殖，成功誘發免疫耐受，而受者體內TCRTreg細胞可存活6個月。但TCR-Treg細胞受主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，難以普遍應用。研究顯示，在TCRTreg 細胞的基礎上，將供體MHC 與Treg 細胞結合，得到CAR-Treg細胞，相比于多克隆Treg細胞，CARTreg細胞抑制能力更強，且可以彌補TCR-Treg細胞的MHC相容性的問題［36-37］。Zhang等［38］認為，CARTreg細胞對IL-2的依賴較TCR-Treg細胞小，可以維持穩定的表型和功能，更容易遷移至靶器官。Noyan等［39］研究中，CAR-Treg 細胞展示了比 nTreg 細胞更強的抑制功能，無論在體外還是在人源化小鼠模型中均可抑制免疫排斥反應。但CAR-Treg 細胞的不足是輸注后有可能引起細胞因子“風暴”和神經系統毒性，另外靶標抗原的選擇、特異性抗體的產生難度較大，容易出現 CAR-Treg 細胞衰竭［38］。UniCARTreg 細胞作為新一代技術產物，可在一定程度上消除MHC 的限制與 TCR 的影響，提高移植安全性［40］，但其在臨床中的實際效果有待進一步研究。

5 胸腺在DSTreg細胞產生中的作用與胸腺移植在誘導移植免疫耐受中的作用

在兒童時期，胸腺是一個高度強大的免疫器官，是T細胞發育、成熟的場所，對于誘導供體特異性耐受非常關鍵。胸腺Treg 細胞由2 部分組成，一部分是由CD4 單陽性胸腺細胞新生成的Treg 細胞，另一部分是進入胸腺再循環的外周Treg細胞。在人類和小鼠中，nTreg細胞幾乎全部依賴于胸腺產生。兒童胸腺中的Treg細胞非常豐富，1 g胸腺組織所含Treg細胞大約是1 mL，是外周血的500倍，而且在擴增后功能穩定［41］。新生兒胸腺的微解剖屏障對外來細胞的限制沒有成人胸腺那么嚴格，更容易產生DSTreg細胞；新生兒胸腺通過消耗進入胸腺的效應T細胞，提高誘導中樞免疫耐受的效果。DSTreg細胞的產生主要是通過胸腺中的抗原呈遞細胞來完成，包括胸腺樹突細胞和胸腺髓質上皮細胞。在現階段的移植模型中，胸腺產生供體抗原特異性Treg 細胞主要有2種方式，一種是供體胸腺（組織）移植，另一種為向受體的胸腺中注射供體抗原。

在臨床上，胸腺移植主要用于治療兒童先天性胸腺缺如或胸腺切除所繼發的免疫缺陷性疾病，如DiGeorge 綜合征等。在移植領域，胸腺移植主要在兒童心臟移植的病例中開展［42］。在基礎研究中，除免疫缺陷病以外，胸腺移植的研究主要涉及供體特異性T 細胞。在一項小鼠胸腺移植的研究中，受體體內供者來源的CD3+T細胞的總數在移植術后前4周內升高，而后開始下降；進入胸腺再循環的初始型CD4+T 細胞的生存期較短，而此時移植物內的胸腺細胞的數量已達到正常小鼠的水平［43］。Yamada等［44］認為在異種移植中，同時行胸腺移植可以產生抗原特異性T 細胞，延長移植物存活時間，但在豬、犬等大動物模型中，所移植的胸腺需要血管重建。Cooper等［45］認為盡管胸腺移植產生的供體抗原特異性T 細胞可延長移植物存活時間，有助于誘導免疫耐受，但由于其有作用時間并非終生、細胞比例偏低等問題，尚不足以實現長期、完全停用免疫抑制劑。

6 結語

隨著手術技術的成熟，器官移植的關注點逐步轉移到提高移植受者的生存質量與遠期存活率，實現免疫耐受是器官移植在挽救患者生命的同時所達到的最理想狀態。DSTreg細胞可保持免疫抑制的抗原特異性，而胸腺移植可維持抗原特異性免疫抑制的持久性，二者的結合或可為今后肝移植提供誘導免疫耐受的新策略。