仿生無機納米材料改造生物體的研究進展

熊 威 唐?？?馬為民 鄒志剛＊,,4

（1南京大學物理學院，固體微結構物理國家重點實驗室，人工微結構科學與技術協同創新中心，環境材料與再生能源研究中心，南京 210093）

（2浙江大學化學系，生物物質與信息調控研究中心，杭州 310027）

（3上海師范大學生命科學學院，上海 200234）

（4南京大學物理學院，江蘇省納米技術重點實驗室，南京 210093）

0 引 言

在地球形成之后的數十億年間，地球上的生命形式一直是原始和低等的，并且主要是以古細菌和原始藻類為主[1]。直到距今5.41億至5.12億年前的寒武紀早期，在2 000多萬年的時間內地球上突然涌現出各種各樣的動物，它們不約而同地迅速起源和出現[2-4]。海綿、腔腸、腕足、節肢、脊索動物等一系列與現代動物形態基本相同的動物在地球上 “集體亮相”，形成了多種門類動物同時存在的繁榮景象[3-4]。這就是地質學上所謂的 “寒武紀生命大爆發”。在這個生物大爆發時期，地球上的生命形式出現了質的變化，最具標志性的是以三葉蟲為代表的甲殼類生物的出現，并且此后出現的更加高等的動物都或多或少具有硬組織結構[4-6]。說明在這個時期，生物體開始學會了利用材料來改造自身去適應環境，而生物體在與環境相互作用中形成自身需要的材料的過程實際上就是生物礦化的過程,因此生物礦化對生物進化和寒武紀生物大爆發起到了至關重要的作用。生物體可以通過生物礦化形成具有復雜精細結構并且生物性能優異的有機-無機復合材料，比如骨骼、牙齒和貝殼等[7-8]。這些生物材料從納米尺度到宏觀尺度都具有高度有序的層次結構，而且它們特殊的結構和性質，可以為生物體提供機械支撐、保護、運動、信號傳感等功能[9-14]。例如，硅藻可以利用環境中的硅酸鹽在細胞表面形成一層結構精致的二氧化硅外殼，并且這層二氧化硅外殼可以為它們提供機械保護、光子晶體和pH緩沖劑的作用[15-17]。還有我們生活中常見的雞蛋，也是一個很典型的例子，雞蛋殼不僅可以為里面的細胞提供機械保護，還能在保持內部細胞活性的同時防止外部細菌的入侵[18-19]。此外，蛋殼還能為內部胚胎的生長提供足夠的鈣源[20-21]。除了保護作用，還有一些細菌可以利用內部的磁鐵礦晶體（Fe3O4或Fe3S4）作為磁傳感器[11,22]。

自然界中的生物礦化現象，是生物體通過生物大分子的調控形成無機礦物的過程，其化學本質是有機分子與無機材料的界面相互作用。生物礦物根據其成分主要可分為兩大類:鈣化的生物礦物和非鈣化的生物礦物[23]。在已發現的生物礦物中，鈣化的生物礦物約占總數的一半，其中碳酸鈣礦物最為廣泛，磷酸鈣礦物次之[7,10]。碳酸鈣礦物主要出現在無脊椎動物中，比如軟體動物的外殼和海膽的刺[7,10]。磷酸鈣礦物則主要出現在有脊椎動物中，最有代表性的就是骨骼和牙齒中的主要成分羥基磷灰石[7,10]。非鈣化的生物礦物種類也很多，最主要的是二氧化硅類礦物，主要存在于硅藻、海綿骨針和一些植物中[7]，其次是在趨磁細菌中發現的鐵的硫化物和氧化物[7,24]。

雖然生物礦化是自然界中廣泛存在的現象，但是還有很多低等生物體不具備生物礦化的功能，而它們往往具有礦化生物體不具有的特殊功能，因此對于這些生物體的改造是非常有意義的。受到自然界生物礦化現象的啟發，越來越多的科學家試圖通過仿生礦化的策略為生物體合成與制備具有特定結構和特殊功能的納米材料，從而達到改造生物體的目的。在過去的十年里，基于生物-材料界面復合技術的生物體改造研究已經逐漸形成一個研究領域，并且引起了來自化學、物理學、材料科學、生物學乃至生物醫學等諸多領域的科學家們的強烈好奇和廣泛興趣。對于通過仿生礦化改造生物體以及基于單細胞殼化的功能化改造方面的研究，國內外已有多篇綜述[19,25-32]。而近年來，通過材料改造生物體的研究已經從最初的單細胞礦化，發展到多細胞聚集，利用的材料體系從最初的生物礦物發展到其他無機納米功能材料，改造的生物體從最初的大腸桿菌和酵母細胞拓展到病毒、藻類和動物細胞等，賦予的功能也從最初的生物保護延伸到能源、環境、醫學、催化等諸多方面。因此，本文對近年來通過材料手段改造生物體的進展做了一個系統的分類和梳理，并對當前的問題和未來的挑戰做了總結和分析。

1 材料在生物界面形成的調控機制

生物礦物的形成過程，比如晶體的成核、生長、形貌、同質異形體類型和組分，通常都受到生物體嚴格的控制，因此生物礦物在形貌、結晶行為和材料性質上與地質學上對應的礦物有著顯著的不同。雖然理解每種礦物特有的形成機制并非易事，但是似乎存在一些對很多生物體都具有普適性的生物礦化調控策略。Mann把這些策略主要歸納為5種[33]:化學控制，空間控制，結構控制，形貌控制和構筑控制。

生物礦化區別于普通礦化最核心的特點就在于有機基質在礦化過程中的調控起著至關重要的作用。因此，有機基質的調控作用在仿生礦化中具有核心地位。仿生礦化中常見的有機添加劑類型主要有聚合物、表面活性劑和低分子量小分子和生物大分子。其中，一些生物大分子對于特定生物材料有特異性的識別能力，并且自身具有較強的可操作性，可以被用來制備具有多級結構的理想模板和用于控制功能復合材料構建。已有研究表明，調控鈣礦化的生物大分子通常都含有羧基（-COO-）[34-39]，而調控硅礦化的生物大分子通常帶有-NH2或-NH-[40-44]。比如通過富含谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和磷酸化絲氨酸（pSer）的蛋白可以控制磷酸鈣生物醫學材料的制備[45-48]，而通過富含精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）或組氨酸（His）的陽性多肽和多胺（polyamine）類似物可以調控二氧化硅硅材料的合成[49]。

目前，仿生礦化的調控機制主要有:模板作用、限域的反應環境、非經典結晶、電/磁場誘導結晶[50]。在生物礦化過程中，有機基質的模板作用是有機分子與無機礦物最主要的一種相互作用。有機分子通過有機-無機界面的分子識別在晶體成核、生長及微結構的有序組裝等方面起到的調控作用在仿生礦化中具有核心地位[45]。仿生礦化中的有機模板主要有2種類型[51-52]:一種是人工合成模板，例如Langmuir-Blodgett（LB）膜、自組裝單層膜、囊泡、微囊、微乳液、膠束、反相膠束、單層分子膜；另一種是生物模板，主要是生物大分子或生物中的有機質，如膠原蛋白、磷脂、脂質體、甲殼素、膽固醇等。在限域的反應環境中的礦化主要涉及到2種策略[50,53]:一種是通過模板的途徑構建限域的有機支架，另一種是利用限域的反應環境，比如納米反應器。另外，中空的蛋白質結構也可以作為限域的反應環境用來合成各種納米顆粒[54-60]。除了模板和限域反應環境中的經典結晶途徑之外，仿生礦化還能夠利用非經典的顆粒誘導的結晶途徑[61]。非經典的結晶過程涉及到預先形成的納米顆粒到一個有序的超級結構的自組裝過程，并且在這個過程之后融合成單晶。電/磁場誘導結晶是指利用電場對帶電離子的作用或磁場對磁性納米顆粒的作用，誘導它們在結晶過程中沿著電場線或磁場線的方向定向排列組裝[62-66]。電場主要影響結晶過程，而磁場還能夠影響納米顆粒的組裝過程,比如控制納米材料的一維、二維甚至三維的組裝過程[63-66]。

2 納米材料改造生物體的方法

經過長期的自然選擇和生物進化，自然界中的大部分生物體學會了利用材料來改造自己，但是很多簡單的生命形式，例如絕大多數的微生物，還不具備利用材料改造自身功能的能力，因而它們更容易受到環境脅迫的干擾。受到自然界生物礦化現象的啟發，越來越多的化學家和材料學家們選擇利用納米材料對這些生物體進行改造[28,31-32]。納米材料改造生物體的關鍵在于材料與生物的結合，核心是生物與材料界面的相互作用對生物體功能的影響。經過近十年的研究和探索，已經發展出了一系列實現材料與生物體結合的方法，但是目前實現納米材料與生物體的結合，主要還是基于仿生礦化的策略。

2.1 表面礦化基團改性誘導礦化

2.1.1 層層自組裝修飾

層層自組裝（layer by layer assembly，LbL）是一種通過交替沉積相反帶電荷的聚電解質分子的表面修飾方法。通過層層自組裝，也能夠賦予表面特殊的活性基團。這種方法最初利用帶電基板在帶相反電荷的聚電解質溶液中交替沉積制備聚電解質自組裝多層膜[67]。由于絕大多數的細胞，表面不具備誘導礦化的活性位點，所以通常需要對細胞進行表面改性，通過層層自組裝可以改變細胞的表面電荷及賦予細胞表面特定的礦化位點，從而實現細胞表面的礦化，并且通過調節聚電解質的吸附時間和層數，可以調控礦化外殼的厚度。對細胞的表面礦化改造，最早是在酵母細胞上實現了磷酸鈣礦化改造[68]，這也是仿生礦化改造生物體的第1個嘗試，并且隨后很多工作都是以酵母細胞為模型細胞開展的。酵母是真核細胞的典型代表，常作為研究的模式生物[69-71]。酵母的細胞壁主要由弱電負性的多聚糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖等組成，缺乏誘導礦化相關的殘基和官能團，因此需要對酵母細胞進行表面修飾[72]。聚二甲基己二烯氯化銨（PDADMAC）是一種富含季胺基并且帶正電的聚電解質，它們可以吸附在酵母細胞表面，當細胞表面帶有一定量的負電荷后，再吸附富含羧基（-COOH）且帶負電的聚丙烯酸（PAA）分子，經過多次交替吸附之后，細胞表面的活性位點就增多了（圖1）。已有的研究已經證明，羧基是誘導鈣礦化的活性位點[34-39]，當細胞表面富含羧基時，可以富集鈣離子，從而誘導表面鈣礦化的發生（圖1），最終形成一層納米尺度的磷酸鈣外殼[68]。

利用層層自組裝技術不僅能夠賦予細胞表面鈣礦化的位點，通過改變最外層的聚電解質，也能將其他的納米材料引入細胞的表面。比如將富含季胺基的PDADMAC暴露在層層自組裝的最外層，就可以誘導細胞表面的硅礦化發生或者吸附納米二氧化硅顆粒，從而在細胞表面形成納米級的二氧化硅外殼[73]。利用類似的方法，選用具有活性位點的多肽替代聚電解質，可以實現對小球藻細胞的納米二氧化鈦包裹[74]。此外，直接利用聚電解質和無機 納米材料或者電荷改性的納米材料進行層層自組裝[75-76]，也能實現對細胞與納米材料的結合。

目前，通過層層自組裝對細胞進行表面改性并實現納米材料在表面的復合是最為常用的細胞功能化改造方法之一，但是這種方法通常需要多次的離心操作，容易對細胞造成機械損傷，并且細胞反復浸在聚電解質溶液中，也會受到聚電解質的毒性影響。因此這種方法對于細胞壁厚、帶電性強的細胞有比較好的適用性，但是對于無細胞壁或者帶電性弱的細胞就不具有很好的適用性，尤其是對無細胞壁的細胞，離心操作會破壞細胞膜結構，從而使改造失去意義。

圖1 酵母細胞仿生鈣礦化示意圖[68]Fig.1 Scheme for biomimetic calcification of yeast cell[68]

2.1.2 直接吸附修飾

對于一些沒有細胞壁結構的細胞，比如哺乳動物細胞，它們的表面功能化改造需要更加溫和的手段和細胞相容性更好的材料，所以一直是細胞功能化改造的難題。2014年，韓國的Choi課題組報道了一種單層聚電解質修飾哺乳動物細胞表面誘導硅礦化的方法[77]。他們將HeLa細胞浸在陽離子聚電解質聚乙烯亞胺（PEI）溶液中，讓細胞表面吸附上一層PEI分子，目的是表面胺基化，然后在正硅酸甲酯（TMOS）的溶液中成功誘導細胞表面的硅礦化（圖2a）將二氧化硅引入到了哺乳動物細胞表面，得益于PEI分子的高正電荷密度和胺基化程度，PEI能夠很好地吸附于HeLa細胞表面并誘導硅礦化的發生，但正因如此，PEI對細胞的毒性也很大，因此還需要尋找細胞相容性更好的聚電解質或其他修飾分子才能使這種方法更加具有應用前景。隨后，Choi課題組又合成了具有硅礦化基團的多肽鏈[78]，通過吸附于酵母細胞表面，賦予其硅礦化的活性位點，實現了硅礦化改造（圖2b）。但是這個改造過程中，需要將表面改性后的酵母細胞置于TEOS溶液中攪拌6 h，這說明人工合成的多肽鏈與細胞的吸附結合能力不強，表面礦化位點不多，并且長時間置于TEOS溶液中也會對細胞活性有影響。2016年，趙瑞波等[79]利用HeLa細胞表面的葉酸受體吸附葉酸分子，再通過葉酸分子對鈣離子的螯合作用，實現了腫瘤細胞的靶向磷酸鈣礦化。此外，蘇寶連課題組也利用L-半胱氨酸結合的金納米顆粒為酵母細胞構筑了一層可自修復的納米金外殼[80]。還有一些研究者基于分子識別原理，通過特異性配體改性納米顆粒，實現與細胞表面的結合[81]。

受到貽貝中的粘合蛋白啟發，多巴胺已經成為界面修飾的可靠媒介[82]。在酵母細胞表面實現多巴胺的聚合是Choi課題組開發的另一種細胞表面改性方法[83]，如果在聚多巴胺外殼上接枝PEI分子，可繼續誘導硅礦化在表面發生[84]。隨后，王本等[85]將多巴胺表面聚合成功應用到紅細胞改造中。但是由于多巴胺在發生聚合時，會發生氧化反應對細胞產生毒性，并且聚合后的多巴胺呈現黑色，因此這個過程對細胞的損傷比表面吸附聚電解質可能更大，所以這種方法的應用有待繼續探究。

圖2 （a）PEI分子改性誘導HeLa細胞表硅礦化[77];（b）R4C12R4短肽改性誘導酵母細胞表面硅礦化[78]Fig.2 （a）Silicification on HeLa cell surface induced by PEImodification[77];（b）Silicification on yeast cell surface induced by R4C12R4 modification[78]

圖3 鈣離子功能化的納米金顆粒輔助石墨烯片與酵母細胞結合[80]Fig.3 Graphene sheets are interfaced with yeast cells,using calcium ion functionalized Au nanoparticles[89]

2.2 金屬離子表面富集誘導納米材料沉積

在一些特殊的生物-材料復合體系中，生物體表面通過富集特殊的金屬陽離子也可以誘導納米材料在其表面形成。很多細胞可以通過細胞膜上的離子受體從環境中吸收過量的鈣離子到細胞內部，因此這些鈣離子的受體可以視為鈣礦化的成核位點和離子結合位點[86-87]。由于鈣離子正二價的特性，鈣離子可以在2個帶負電的分子間起到 “橋聯”的作用。利用鈣離子的“橋聯”作用，檸檬酸鹽改性的金納米顆粒與氯化鈣溶液共混可以引發金納米顆粒在酵母細胞壁外表面形成一層金納米殼[88]。根據這個策略，將酵母細胞浸入還原石墨烯和鈣離子結合的金納米顆粒混合溶液中，可以賦予酵母細胞一層還原石墨烯材料的外殼（圖3）[89]。此外，鉻離子在熱醋穆爾氏菌細胞表面富集，在光照和半胱氨酸的存在下，可以誘發硫化鎘納米顆粒在細胞表面形成[90]。此外，一些表面帶負電的病毒納米顆粒表面，也能夠直接吸附陽離子，使局部過飽和度增加，從而引發表面納米材料沉積[91]。例如，日本腦炎疫苗在富含鈣離子的模擬體液中表面可以富集大量的鈣離子從而引發原位的鈣礦化，形成一層磷酸鈣納米外殼[92]。與前面提到的層層自組裝改性誘導納米材料沉積不同，這種方法操作步驟更加簡單，對生物體的機械損傷更小，但是這種方法通常需要生物體具有相對高的比表面積和表面電荷密度，適用性不如層層自組裝改性的方法。

2.3 基因改造

自然界中的生物礦化現象都是受到基因調控的，是生物體可遺傳的自發行為。但是目前人工對生物體的納米材料改造都是不可遺傳的，而且由于是非自發的行為，所以對生物體本身是有損傷的。因此，將與礦化蛋白相關的基因導入到生物體中，讓其表達并進行自發的礦化是一種更為理想的策略。

科學家們已經對一些生物體做了礦化基因改造的嘗試，例如在畢赤酵母（pichiapastoris）中過表達溶菌素酶和在大腸桿菌中過表達硅礦化蛋白都可以誘導硅礦化在表面發生[93-94]。與細胞的基因工程改造相比，病毒的基因工程改造相對更加容易。Belcher課題組長期利用基因改造的M13噬菌體誘導無機納米材料的生長，并且得到了許多形貌結構特殊的納米材料[95-98]。王廣川等[99]在多年病毒礦化的研究基礎上，通過對減活的人類腸道病毒71型（EV71）的 cDNA 進行基因改造（圖 4a），獲得了可以表達成核多肽誘導磷酸鈣礦化的病毒（圖4b），并且這種基因改造對病毒的活性影響很小，而礦化后的病毒卻有了更好的熱穩定性。通過基因改造賦予生物體礦化能力，相比于單純通過化學與材料手段的改造，最大的優勢是這種改造是可遺傳的，但是對于其他功能的影響也是不可逆的。目前基因工程改造生物體的礦化功能，只在病毒、大腸桿菌和酵母等一些模式生物中實現，更加廣泛的應用還有待于基因功能的研究及基因工程和材料技術的發展。

圖4 基因改造誘導病毒自礦化[99]:（a）EV71基因組及在EV71基因組中的插入位點（VP1 蛋白上 β-（B-C）-loop）;（b）改造后的病毒原位鈣礦化Fig.4 Genetic modification-induced virus self-biomineralization[99]:（a）EV71 genome and the insertion site of the β-（B-C）-loop of VP1;（b）Gene engineered virus calcium mineralization in situ

2.4 礦化誘導聚集

在生物進化的過程中，單細胞到多細胞的轉變是一個十分重要的變化，是生命由低等向高等進化的第一步。自然界中許多高等的生命體，都是以多細胞形式存在的，并且存在細胞的功能分化，而這種現象是單細胞生物所不具有的。在從單細胞到多細胞的轉變過程中，首先需要細胞在空間上相互接近，形成細胞團簇，最后發生聚集，細胞空間位置和微環境的差別誘導細胞發生功能差異[100-102]。受到生物進化的啟發，如果可以實現人工誘導和調控細胞的聚集，那么就有望發現生物體的新功能。目前，利用陽離子聚電解質PDADMAC的“橋聯”作用，在誘導仿生硅礦化的同時，可以實現小球藻細胞的聚集（圖5），并且發現聚集的小球藻在有氧條件下可以持續產生氫氣[103]。不僅如此，直接使用二氧化硅納米顆粒，在PDADMAC的“橋聯”作用下，也能誘導藍藻細胞的聚集[104]。2種方式都是利用仿生硅礦化的策略，各有優缺點，前者可以獲得更加穩定的聚集體結構，但操作更加復雜，不適合大規模應用，后者操作簡便有大規模應用的前景，但是獲得的聚集體結構不如前者緊致和穩定。最近，通過仿生硅礦化誘導細胞聚集改性的策略也應用到了基因改造后的大腸桿菌[105]，說明這種方法具有一定的普適性，可以拓展到其他生物體的改造中。如果能解決生物相容性和聚集體結構可控性的問題，將是一種非常有前景的生物改造策略。

圖5 仿生硅礦化誘導小球藻細胞聚集[103]Fig.5 Cell aggregation of Chlorella induced by biomimetic silicification[103]

2.5 其他方法

以上介紹的方法都是基于生物體表面的改性實現的納米材料復合，實際上在一些特殊的生物-材料體系中，一些生物體也可以直接與材料結合。比如，早在1989年，就有科學家利用溶膠-凝膠法實現了二氧化硅對酵母的包埋[106]，隨后這種方法也應用到了細菌、藍藻等生物體系[107-109]，但是這種方法對細胞的改造很難做到單細胞化或者納米化，容易使很多細胞被包埋在成塊的材料中，同時也會釋放出醇類物質毒害細胞。王廣川等[110]發現EV71病毒納米顆?？梢栽诠杷嶂袑崿F原位硅礦化（圖6），為病毒的礦化改造提供了一種新的便捷途徑。此外近期的研究還發現，小球藻細胞可以自發地吸附帶正電的二氧化鈰納米顆粒，形成外殼包裹在細胞表面[111]。這些生物-材料直接復合的方法，簡便快捷，有利于大規模應用，但是需要生物界面與材料特性的良好匹配。例如，大規模的大腸桿菌硅礦化包裹，可以通過噴霧干燥技術來實現，并且包裹后的細胞活性得以保持，是一種有前景的大規模實現生物體包裹的技術[112]。

圖6 EV71病毒納米顆粒原位硅礦化[110]Fig.6 In situ silicification of EV71 virus nanoparticle[110]

圖7 酵母細胞內部碳酸鈣納米殼形成機制[113]Fig.7 Formation mechanism of CaCO3 nanoshell in yeast cell[113]

在自然界中，趨磁細菌能夠在其細胞內部合成由磁鐵礦（Fe3O4或 Fe3S4）組成的“指南針”，為它們定向運動提供保障[1,22]。這些在內部通過礦化形成的具有特殊結構的納米生物材料對生物體的功能也起到十分重要的作用。受到自然界生物體內部礦化的啟發，研究者也開始思考如何能夠在生物體內部合成納米材料從而對生物體實現功能化改造。例如，楊林課題組[113]通過用麥芽糖促進酵母的呼吸作用，在飽和氫氧化鈣溶液中，利用酵母呼吸作用放出的二氧化碳與氫氧化鈣反應，最終在酵母細胞內部形成一層5 nm的碳酸鈣礦化層（圖7）。隨后，又有一些研究報道，在其他微生物細胞內部合成了不同形貌結構和組成的金屬納米顆粒，大致機制是利用微生物細胞內部特有的還原能力將進入到內部的金屬離子還原成金屬單質。相比于對細胞表面的改造，對細胞內部的改造需要對細胞生理代謝途徑有更深刻的理解，并且細胞內部的納米材料對細胞的影響也有待深入探究，因此這是一種既新穎又有挑戰性的方式。

圖8 （a）正常酵母和磷酸鈣礦化酵母的生命循環示意圖;（b）正常酵母細胞與磷酸鈣礦化的酵母細胞在純水中隨時間的存活率，插圖部分為存放30 d后相應的酵母活性圖（酵母live/dead活性染色試劑盒，紅色為活細胞，綠色為死細胞）;（c）磷酸鈣礦化的啤酒酵母脫殼前后生長曲線。礦化酵母不能分裂增殖，在t=60 h脫殼處理（1 mmol·L-1鹽酸）后，酵母恢復繁殖;（d）正常酵母與礦化酵母在溶菌酶存在條件下的存活情況[68]Fig.8 （a）Life cycle of normal yeast cells and the encapsulated cells;（b）Curves showing the percentage of living cells in pure water against time;The insets are the corresponding fluorescent images after 30 d（the red spots imply that the cells are still alive,and green spots represent the dead cells）;（c）Growth curve of S.cerevisiae cells with and without the mineral shells;Mineralized yeast cells cannot divide and proliferate;1 mmol·L-1 HCl was added at t=60 h to induce the dissolution of the mineral shell,and then yeast cell recovered proliferating;（d）Survival of S.cerevisiae cells in the presence of zymolyase[68]

3 納米材料對生物體的功能改造及其應用

本文所綜述的仿生無機納米材料改造生物體研究進展，主要是針對細胞和病毒的改造，因為這些低等的生物體通常有一些特有的功能，而且在尺寸上適合做納米材料的改造，結合納米材料的尺寸效應，就有可能產生特殊生物-材料相互作用，從而影響或改變生物體的功能，同時生物-材料的界面也對納米材料的形成造成影響。以下將分類介紹近十年來納米材料在生物體的功能改造及其應用中的進展。

3.1 生物保護

自然界中的很多生物體，都會受到外界脅迫的影響，尤其是低等的生物體，更加容易受到外界因素影響，所以納米材料對生物體的保護作用是其他功能改造的基礎。目前納米材料在生物體改造中的應用，有很大一部分是基于對生物的保護作用。由于不同的保護作用，從而產生了不同的功能和應用。

3.1.1 細胞保存

受到雞蛋殼的啟發，王本等[68]通過層層自組裝表面改性的方法首次實現了酵母細胞的表面鈣礦化，人工賦予了酵母細胞一層700 nm厚的磷酸鈣外殼。磷酸鈣單細胞包裹后的酵母細胞依然能保持其活性，并且能夠控制細胞的分裂,將細胞維持在休眠狀態（圖8a），因此磷酸鈣包裹的酵母細胞比普通的酵母細胞在純水中的保存時間更長[68]。在1個月的時間內，普通酵母細胞的死亡率接近80%，而磷酸鈣包裹的酵母細胞的死亡率約為15%（圖8b）。這可能是因為磷酸鈣外殼起到了阻礙細胞與外界環境之間的物質交換和細胞之間信息交流的作用。當磷酸鈣外殼在pH=5.5的弱酸環境中溶解后，酵母細胞又可以重新分裂（圖8c）。這層磷酸鈣外殼還能幫助酵母細胞抵抗外來侵害，比如在細胞裂解酶存在下，普通的酵母細胞在3 h就幾乎全部發生裂解，而有磷酸鈣外殼包裹的酵母細胞大部分保持完好的形態（圖8d）。隨后Choi課題組[73,84]先后利用仿生硅礦化實現了酵母細胞和HeLa細胞的二氧化硅包裹。硅礦化后的酵母細胞表面有一層30 nm厚的二氧化硅外殼，也具有長期保持細胞活性的作用，在純水中放置30 d，礦化細胞存活率為56%，而普通酵母細胞僅為24%，并且二氧化硅包裹幾乎完全限制了細胞分裂。對HeLa細胞的表面硅礦化雖然會對細胞活性有損傷，但是隨著培養時間的延長，未礦化處理的HeLa細胞存活率顯著下降，而礦化后的細胞存活率下降得明顯更加緩慢。這些工作表明細胞的納米材料包裹是實現細胞保存的途徑，Choi課題組[27,90]還在一些文章中提出了“人工孢子”的概念，也是對細胞保存這個應用的一個印證。

圖9 （a）正常酵母細胞未經熱處理的切片TEM圖片;（b）正常酵母細胞52℃熱處理2 h后的切片TEM圖片;（c）二氧化硅包裹的酵母細胞未經熱處理的切片TEM圖片;（d）二氧化硅包裹的酵母細胞52℃熱處理2 h的切片TEM圖片[75]Fig.9 （a）TEM image of native yeast cell without heat treatment;（b）TEM image of native yeast cell after 2 h treatment at 52 ℃;（c）TEM image of silica-coated yeast cell without heat treatment;（d）TEM image of silica-coated yeast cell after 2 h treatment at 52℃[75]

3.1.2 熱保護

熱穩定性是生物保存的一個關鍵因素，因為高溫會使蛋白質的構象發生變化，甚至導致蛋白質失活[114-115]，而且也會對生物體產生熱脅迫，所以提高生物和蛋白制品的熱穩定性是十分必要的。自然界中的許多植物如水稻、馬尾草和仙人掌等的表面具有二氧化硅礦物層，而且相關研究表明這種礦物層除了提供機械支持和預防病原菌入侵等功能外還具有保持水分和增強其耐熱性的功能[116-118]。受到自然現象的啟發，王廣川等[75]通過層層自組裝改性和靜電吸附的方式，賦予酵母細胞一層二氧化硅納米外殼，并且發現二氧化硅包裹的酵母細胞可以在49～53℃范圍內保持活性，而普通的酵母細胞在52℃時僅有50%的存活率。在透射電鏡下觀察細胞切片，二氧化硅納米外殼在熱處理下并沒有發生明顯的結構變化，而普通酵母細胞壁在熱處理時則有明顯的形變，這說明納米二氧化硅的外殼起到了保持細胞結構和限制形變的作用（圖9）。此外，Choi課題組[119]通過二氧化硅和二氧化鈦的復合納米外殼也能為小球藻細胞提供熱保護的功能。

減毒活疫苗是一種非常典型的生物制品，對于人類對抗傳染病具有十分重要的意義，但是它具有溫度敏感性，它的運輸和保藏過程必須采用低溫環境（如冷凍）[120-121]。據統計，由于儲藏或運輸不當，每年約有50%的疫苗被浪費[122]。因此，改善疫苗的熱穩定性對于減少冷鏈開支和疫苗浪費都具有重要的意義。王廣川等[92]通過原位礦化的方式成功制備出磷酸鈣礦化的乙腦病毒（JEV）疫苗（圖 10a），且礦化形成的磷酸鈣外殼在不影響疫苗本身基本生物學和不損失其免疫原性的條件下顯著提高了疫苗的熱穩定性（圖10b）。在室溫下，磷酸鈣礦化的疫苗可以至少保存1周，而非礦化的疫苗最多保存2 d（圖10c）[92]。并且在室溫下存放1周后，礦化的疫苗活性和新鮮的疫苗活性相當（圖10d）[92]。但是，很多疫苗由于缺乏誘導磷酸鈣礦化成核的官能團，難以通過直接礦化的方式制備出這種具有核-殼結構的熱穩定疫苗。因此，利用基因工程的手段將成核多肽的基因片段插入到病毒的序列中，就能得到具有自礦化功能的疫苗[99]。表面嵌合了具有促進磷酸鈣礦化的多肽的腸道病毒（EV71），可以在富含鈣離子的溶液中自發地發生礦化，形成一層納米磷酸鈣層[99]。而且研究發現此磷酸鈣自礦化的病毒疫苗具有良好的免疫原性和顯著增強的熱穩定性。重要的是，這種具有自礦化能力的疫苗是通過基因工程手段制得，因此被賦予的礦化能力是可遺傳的。

圖10 （a）磷酸鈣礦化疫苗的TEM圖片;（b）JEV和B-JEV在小鼠腎細胞BHK-21中的一步生長曲線;（c）原病毒 JEV（實心）與磷酸鈣礦化病毒 B-JEV（空心）在 26 ℃下的熱穩定性;（d）分別用 JEV、B-JEV或熱處理以后的JEV、B-JEV免疫小鼠，免疫2周后小鼠脾細胞中γ干擾素表達水平（SFC是指斑點形成細胞）[92]Fig.10 （a）TEM image of B-JEV particles;insert is negatively stained B-JEV;（b）One-step growth curves of JEV and B-JEV on baby-hamster kidney （BHK-21）cells;（c）In vitro assessments of thermostability.Remaining infectivity of JEV （solid）and B-JEV （hollow）after the storage at 26 ℃;（d）Production of INF-γ by T cells of mice immunized with JEV or B-JEV（SFCstands for spot-forming cell）[92]

盡管磷酸鈣礦化疫苗的熱穩定性顯著提高，但是這種疫苗策略僅能在室溫環境中儲存1周左右。自然進化中從溫泉細菌到抗逆植物都選擇了無定形硅礦物，而且有研究表明硅可以通過表面羥基與周圍水分子形成氫鍵而禁錮水分子的流動性[123-124]。為了進一步探索生物礦化策略在提高疫苗的熱穩定性方面的潛力，王廣川等[110]研究了二氧化硅礦物在此方面的表現。實驗證明，完整的二氧化硅礦物殼會讓病毒疫苗喪失活性，但是不連續的硅礦物層則可實現在不影響疫苗活性的情況下大大增強其熱穩定性。通過調節硅酸的pH值，實現了病毒疫苗的原位硅礦化，在疫苗表面引入大量的以錨定形式存在的無定形硅納米簇。體外實驗證明硅礦化的疫苗熱穩定性增加了約10倍，可以在室溫下保存35 d[110]。但是對于那些表面缺乏礦化活性位點的病毒來說，通常需要對其進行表面化學修飾。通過PEI對病毒疫苗表面進行修飾后[125]，可以實現疫苗的表面硅礦化，并且大幅度提高疫苗的熱穩定性，以JEV病毒疫苗為例，硅礦化后可以在室溫下保存至少15 d。因此，硅礦化比磷酸鈣礦化在改善疫苗熱穩定性方面更具優勢。此外，周航宇等[126]還發現納米三氧化鋁包裹疫苗可以同時提高熱穩定性和免疫原性，為疫苗的納米改造提供了另一種策略。

對生物體的熱保護，其實質主要還是保護生物體中的蛋白質和酶，而且蛋白質和酶的保存在藥物制品的保存中也具有非常重要的意義。楊宇玲等[127]通過原位礦化的方法將過氧化氫酶包裹于無定形磷酸鈣納米顆粒中（圖11），使得過氧化氫酶在活性和結構方面均表現出更高的熱穩定性。更重要的是，研究還發現這層磷酸鈣礦化外殼除了以其剛性結構為蛋白質起到固定作用外，無定形相中存在的結構水才是給予蛋白質高溫保護的關鍵因素。無定形礦物中穩定的結構水分子與蛋白質緊密結合，以更為穩定的水合物形式抑制了蛋白質與外界環境中水分子的氫鍵交換，減少高溫條件下水分子劇烈運動對蛋白分子結構造成的破壞，從而提高蛋白分子的熱穩定性。這種以生物礦化為基礎的材料-蛋白相復合的方法不僅為今后蛋白或其他生物大分子的改性提供了一個新的思路，同時也為礦化提高生物體熱穩定性建立了一個理論模型。

圖11 無定型磷酸鈣礦化包裹的過氧化氫酶結構示意圖[127]Fig.11 Schematic view of the entrapped enzyme inside the calcium phosphate （ACP）-catalase （CAT）nanocomposite[127]

3.1.3 光保護

隨著人類對可再生能源需求的增長，生物質由于其潛在的作用引起了人們高度的關注。光合微生物，包括藍藻，綠藻和硅藻等微藻，是地球上最重要的初級生產力供應系統[128-130]。以藍藻為例，從全球范圍來看，每年約有250億噸的碳以二氧化碳的形式被藍藻固定到高能量密度的生物質中[131-132]。藍藻幾乎存在于所有的陸地和水生環境中，為地球提供了20%～30%的光合生產力并且以大約450 TW的速率將太陽能轉化為生物質儲存的化學能[128]。所以藍藻對于解決日益增加的能源需求和環境問題能夠起到十分重要的作用。但是，自然界中微生物的光合作用通常是一個低效率的過程，因為它們的光能自養生長總是受到各種環境脅迫的影響[133-134],例如藍藻的光合作用對強光非常敏感，過度的光照可以顯著抑制藍藻的光合作用甚至會導致光合器官的光氧化損傷[135-137]。因此，光抑制是造成生物質損失的主要原因之一。所以減緩強光脅迫造成的光抑制對增加光合作用產物起著非常重要的作用。

自然界中的硅藻可以通過生物硅礦化形成結構精致的納米二氧化硅外殼為自身提供機械保護和光子響應[130]。這個納米結構的外殼也被認為是硅藻具有更高光合作用效率的重要原因。受到硅藻的啟發，熊威等[138]選取藍藻集胞藻PCC 6803（Synechocystis sp.strain PCC 6803）為模式生物，通過仿生礦化的手段人工賦予藍藻表面一層納米級的二氧化硅外殼（圖12a）。通過研究細胞表面二氧化硅外殼的光學性質，發現二氧化硅外殼可以幫助藍藻細胞阻擋很大一部分的光照（圖12b）[138]。因此，在強光照條件下，二氧化硅礦化的藍藻比正常的藍藻具有更高的光合活性（每毫克葉綠素a每小時的氧氣釋放量）（圖12c）[138]。從某種程度上說，這種細胞外的硅礦物成為了生物體對抗強光照射的納米“防護服”。這樣一種基于材料技術對細胞的改性促進了藍藻在強光下的光合作用，從而增加了光合生物質的產量。生物質合成的增加不僅可以用來生產更多的生物能源，還有助于緩解溫室效應。

圖12 （a）藍藻細胞表面仿生硅礦化過程示意圖;（b）普通藍藻細胞（紅線）與礦化藍藻細胞（藍線）的紫外可見光譜（投射模式）;（c）普通藍藻細胞（紅線）與礦化藍藻細胞（藍線）在不同光照的以1,4-對苯醌（BQ）為電子受體時的光合放氧速率[138]Fig.12 （a）Procedure for silica encapsulation of individual cyanobacteria.LbL deposition of PDADMACand PSSonto the cell surface induced the formation of silica coating;（b）UV-Vis spectra of native cyanobacteria （black curve）,PDADMAC/PSSmultilayer-coated cyanobacteria （red curve）,cyanobacteria@SiO2 （blue curve）in the transmission mode;（c）Photosynthetic evolution of O2 with 1,4-benzoquinone （BQ）as the artificial electron acceptor in native cyanobacteria and cyanobacteria@SiO2 cells under different light intensities[138]

圖13 （a）納米二氧化鈰一步法包裹小球藻抗紫外保護[111];（b）磷酸鑭鈰鋱外殼保護斑馬魚卵細胞在紫外線輻射下發育[145]Fig.13 （a）Scheme of One-Step CeO2 Nanoshell Formation on the Chlorella Cell for UV Protection[111];（b）Scheme of La0.20Ce0.45Tb0.35PO4 shell for guarding embryo development of zebrafish against UV radiation[145]

隨著人類活動的影響不斷擴大，地球環境逐漸惡化，其中令人矚目的一個問題就是平流層中臭氧層密度的下降[139]。在過去的近10億年間，大氣中的臭氧層保護著地球上的生物免受有生物傷害性的中波段紫外線（UVB）的傷害[140]。紫外光輻射不僅會對浮游植物產生脅迫[141]，也會對水生動物產生傷害[142-143]。自然界中的顆石藻可以利用表面特殊的球霰石外殼提高它對紫外線的散射能力，從而緩解紫外光脅迫[144]。受到自然界礦化外殼保護生物體的啟發，段鵬強等[111]通過構建納米二氧化鈰外殼單細胞包裹小球藻細胞，實現了對紫外光脅迫的緩解（圖13a），而王本等[145]通過仿生礦化的手段為斑馬魚受精卵細胞構建了一層磷酸鑭鈰鋱的外殼，這層外殼可以吸收特異性的紫外線輻射，從而為斑馬魚受精卵細胞的發育提供紫外保護（圖13b）。

3.1.4 生物隱身

分子識別是生物體內許多界面相互作用的基礎，可以幫助生物系統傳遞信號和抵抗外源性侵害，比如免疫反應就是生物體基于分子識別做出的防御反應[146-147]。但是，目前的生物醫學治療效率嚴重受到不必要的免疫反應制約。例如，病毒載體由于可以把基因導入各種人體細胞中，已經被用于基因治療[148-149]。但是活體實驗發現病毒納米載體總是被人體當作外源性生物體識別，進而被抗體中和甚至快速清除[150]。這種不必要的識別和清除極大限制了病毒載體在生物醫學中的應用。由于這種識別依賴于病毒表面和特殊生物大分子的特異性相互作用，因此屏蔽病毒表面與生物大分子結合的位點是消除這種識別的一個有效途徑。

化學修飾是改變生物界面的常用方法。王曉雨等[151]首先用過陰陽離子聚電解質層層自組裝的方法對人類黃熱病疫苗17D（YF-17D）表面改性后，發現病毒的感染性被限制了，說明表面抗原被屏蔽了。但是這種方法將病毒納米顆粒包裹后，當病毒載體進入細胞后，表面這層聚電解質層無法脫除，因此這種改性方式還是有較大的局限性。受到自然界仿生礦化的啟發，王曉雨等[152]對腺病毒血清型5（Ad5）實現了原位的磷酸鈣礦化，并首次提出了“基于生物礦化的病毒殼工程”這個概念。磷酸鈣礦化后的Ad5，可以規避抗體的中和作用，進入到細胞中，并且釋放出病毒載體，并且依然具有侵染性[152]。隨后，王曉雨等[153]進一步將能表達猴免疫缺陷病毒（SIV）包膜蛋白的重組腺病毒血清型 5（rAd5-Env）進行磷酸鈣礦化。礦化后的病毒能規避Ad5抗體的預免疫，最終增強包膜蛋白特異性的T細胞免疫反應（圖14a）。這項研究為艾滋?。℉IV）疫苗在內的疫苗優化與改造提供了一種全新思路。此外，王曉雨等[154-155]還將磷酸鈣礦化修飾用于鼻接種疫苗和登革熱病毒的改造，并且實現了對體內預存抗體的免疫，進一步將“基于生物礦化的病毒殼工程”這個概念在生物隱身中應用。最近周航宇等[156]發現磷酸鈣礦化的禽流感病毒（圖14b）可以同時增強熱穩定性和感染性，并可能導致禽流感病毒傳染給人類。

分子識別在人體中的另一個重要用途就是識別血型。人的血型是由紅細胞表面的抗原蛋白決定的，例如最常見的ABO血型系統，A型血的紅細胞表面帶A型抗原，B型血的紅細胞表面帶B型抗原。進行輸血時，受血者血漿中的抗體會識別供血者的紅細胞表面抗原，如果血型不匹配，抗體就會把它們定義為“外來物種”，并向它們發起進攻，造成嚴重的后果，甚至還會致命[157]。王本等[85]利用多巴胺表面聚合對紅細胞進行改造，通過聚多巴胺的包裹屏蔽了紅細胞表面的抗原，使得紅細胞在血型錯配的情況下，依然不發生抗原免疫反應。這種紅細胞改造的方法為“萬能血”的制造提供了一種新的策略，但是離實際應用還有一段距離。

圖14 （a）礦化病毒克服預存免疫的示意圖[153];（b）禽流感病毒磷酸鈣礦化示意圖[156]Fig.14 （a）Scheme of vaccine engineering with mineral shell for overcoming preexisting immunity[153];（b）Scheme of CaPshell formation on avian influenza virus[156]

3.2 癌癥治療

癌癥是全世界導致大量人口死亡的主要原因之一，并且癌癥發生率還在持續增加[158-159]。目前，癌癥的治療方法還是限于化療、放療和手術。不幸的是，化療和放療通常會對正常細胞也產生副作用，而手術雖然可能把原發性腫瘤和可見轉移的腫瘤全部移除，但腫瘤總是傾向于侵犯相鄰組織或者擴散到其他微小不可見的區域，這是限制手術清除效果的主要因素[160-163]。近年來，納米技術在癌癥治療中的研究為癌癥的治療提供了很多新的思路和方法[164-168]。但是納米材料的體內細胞毒性、生物安全性以及在人體內的富集都是富有爭議的，因此限制了其在生物醫學中的應用。

研究發現，葉酸受體在很多人體癌細胞中的表達會比正常細胞中上調，而葉酸受體可以導致葉酸分子的積累[169]。葉酸分子中的羧基可能特異性螯合鈣離子進而誘導生物鈣化的發生[169-170]。之前王本等[68]的研究表明，當細胞被礦物包裹后，細胞的生理行為將會改變，特別是細胞的生長和增殖將受到抑制。因此，趙瑞波等[79]提出通過癌細胞的靶向鈣化（CCTC）來抑制腫瘤細胞的生長和轉移進而達到治療癌癥的目的，并且通過實驗證實癌細胞可以通過表面上調的葉酸受體結合更多的葉酸從而誘導磷酸鈣在表面礦化沉積，而正常的細胞不會發生鈣化（圖15a）。在體內實驗中，通過癌細胞靶向鈣化，腫瘤最后轉變為鈣化的組織，而鈣化會破壞腫瘤細胞的細胞膜最終導致腫瘤細胞死亡（圖15b和c）[79]。這項研究通過人工誘導病理礦化，將不可逆的癌癥轉化為可以治療的組織硬化，為癌癥治療提供了一種無需藥物的新策略。

圖15 （a）癌癥細胞靶向鈣礦化（CCTC）示意圖;（b）體內CCTC處理后的腫瘤Micro CT檢測照片;（c）體內CCTC處理后的腫瘤組織切片TEM圖（內部為鈣化組織元素分析圖）[79]Fig.15 （a）Scheme of cancer cell-targeting calcification （CCTC）;（b）Micro computed tomography （μCT）detection of tumours in vivo CCTCtreatment;（c）TEM images and （inset）energy-dispersive X-ray spectroscopy （EDX）of calcified matter in tumour cellular gaps[79]

3.3 生物催化

微生物能夠合成很多不同的酶用于工業催化反應，但是一個重要的問題是這些酶離體后在有機溶劑中很容易被破壞，因此基于全細胞的水/有機兩相生物催化是一個很好的實現低水溶性物質轉化的方法，但是細胞長期置于有機溶劑中會產生致命的損傷從而降低催化效率[171-174]。于是細胞包埋的策略被用于改善微生物的催化活性和穩定性[175]，而這種方式又會降低細胞內外的傳質從而影響催化效率。因此需要設計理想的細胞包埋體系使得微生物細胞在保持活性的同時不降低催化效率。在皮克林界面反應體系中，膠體顆?？梢酝瑫r穩定乳液并催化兩相界面的反應，所以很適合用于生物催化[176-179]。為了改善細菌在皮克林試劑中的穩定性，曲曉剛課題組[175]首先對糞產堿桿菌細胞進行仿生鈣礦化包裹并同時負載磁性四氧化三鐵納米顆粒，然后在磷酸鈣礦化層表面吸附磷酸單十二烷基酯鈉鹽（sodium monododecyl phosphate）以增強表面潤濕性，最后放入皮克林催化反應體系中（圖16）。改造后的細菌在皮克林催化反應體系中，可保持長期的催化活性和穩定性，并且這種生物催化劑可以重復使用30個周期[175]。這種基于細胞殼工程的改造方法，對于其他的兩相全細胞催化體系也具有很高的參考價值。此外，曲曉剛課題組[180]還通過仿生礦化的方法為酵母細胞構建了一層二氧化錳納米酶外殼，納米二氧化錳外殼可以幫助酵母清除環境脅迫產生的自由基，從而對細胞起到響應保護作用。

圖16 磷酸鈣包裹的細菌用于皮克林界面生物催化的示意圖[175]Fig.16 Scheme of bioconversion by the robust Pickering interfacial biocatalyst of calcium phosphate （CaP）-encapsulated cells[175]

3.4 生物能源

生物能源是指通過生物的活動，將生物質、水或其他無機物轉化為沼氣、氫氣等可燃氣體或乙醇、油脂類可燃液體為載體的可再生能源[181]。隨著化石能源大量使用帶來的環境問題日益嚴重，生物能源在可再生能源中的重要性越來越引發各國的關注。在所用的生物能源中，以微藻生物能源為代表的微生物能源被認為是最有前景的生物能源形式[181-182]。但是目前微生物能源的開發和利用，還主要受到微生物本身功能的限制，因此，需要尋找理想的微生物或者對微生物進行人工改造。目前，通過納米材料改造微生物在生物能源中的應用已有初步進展。

3.4.1 光合產氫

氫氣被認為是一種有前景的化石燃料替代物，因為氫氣燃燒轉化效率非常高，對環境友好并且具有高能量容量。但是，當前氫氣的生產主要依賴于烴類的裂解、煤的氣化和水的電解，然而這些生產氫氣的途徑本身就是十分消耗能源的，并且是不可持續的[183-184]。因此，氫氣的綠色生產一直是科學界和工業界的巨大挑戰。光合生物制氫為氫氣生產提供了一種可持續的并且是碳中性的途徑，因為這個過程直接利用光能和水[185]。在自然界中，光合微生物，尤其是綠藻，能夠在光合系統和氫化酶的共同作用下將水光解生成氫氣[186-187]。但是，這通常是一個十分短暫的過程，并且只發生在黑暗和光照交替的幾分鐘之內[188]。這是因為氫化酶遇到氧氣極其容易喪失其功能[189]。在黑暗中，細胞的呼吸可以為激活氫化酶創造厭氧的條件[190-191]。在從黑暗轉變為光照的短暫時間內，在光合系統II（PSII）反應中心通過水的光氧化反應（H2O→2H++1/2O2+2e-）產生的光合電子能夠被傳遞到氫化酶，在氫化酶的催化作用下與質子結合產生氫氣（2H++2e-→H2）[192]。但是，光合作用產生的氧氣會使氫化酶迅速失活，所以產氫時間極其短暫并且效率低下，綠藻在自然有氧條件下產氫的大規模應用還尚未現實。

當前，對生物光合產氫的研究主要集中在單細胞水平，但是，自然界還有很多生物代謝過程涉及到細胞形成細胞集群并表現出新的功能[193-194]。聚集能夠影響細胞之間的溶質流動和通訊，并因此導致不同于單一細胞的生物學特性產生[195-196]。熊威等[103]通過仿生硅礦化誘導小球藻細胞的聚集，發現聚集的小球藻能在自然有氧的條件下進行光合產氫。在60 mL的玻璃管中加入30 mL的藻液，細胞密度為1.2×108mL-1，置于 100 μE·m-2·s-1的光照下，對于正常的小球藻細胞懸液，在每個檢測時間點，頂空中都不能檢測到氫氣，而小球藻聚集體可以連續穩定的以大約 0.35 μmol·h-1·mg-1的速率（每毫克葉綠素每小時所釋放的氫氣含量，下同）釋放氫氣[103]。這個速率大約是自然界中瞬間生物光產氫速率（大約0.20 μmol·h-1·mg-1）的 1.75 倍[103]。更重要的是，小球藻聚集體的光合產氫過程可以持續至少48 h（圖17a）[103]，而不是短暫的幾分鐘。小球藻聚集體中的氫氣和氧氣分布在小球藻細胞聚集體中，存在著空間上的功能分化（圖17b和c）。表層的細胞暴露在外界環境中，它們的功能與正常的細胞相似[103]。但是外部的細胞還能在一定程度上起氧氣防護殼的作用，阻擋外界氧氣滲透到聚集體內部中。聚集體內部的細胞通過呼吸作用消耗擴散進來的氧氣和光合作用產生的氧氣，從而創造一個缺氧的微區[103]。在這個微區中，氫化酶和PSⅡ的活性可以同時得到維持，為可持續的光合產氫提供了保證。

圖17 （a）正常的小球藻和聚集的小球藻在100μE·m-2·s-1的持續光照和有氧條件下的光合產氫積累量和密封管頂空中的氧氣體積分數（重復實驗次數n=6）;（b）小球藻聚集體的空間功能分化;（c）不同尺寸大小的小球藻聚集體中氫氣（藍色）和氧氣（紅色）濃度分布（n=5）[103]Fig.17 （a）Amount of H2 and the content of O2 in the headspace of sealed tubes under a light intensity of 100 μE·m-2·s-1 at different time periods （n=6）;Red lines:O2,Blue lines:H2;Open squares:native Chlorella;Filled circles:aggregated Chlorella;（b）Spatial-functional differentiation in aggregated Chlorella cells;（c）H2 （blue）and O2 （red）microprofiles of aggregated Chlorella with different sizes （n=5）[103]

這是人類首次通過材料技術實現有氧條件下長時間可持續的微藻光合產氫，該突破對于實現大規模的微藻光合產氫和促進綠色能源的發展都具有非常重要的理論指導意義。這種基于化學和材料的細胞改性手段不僅具有可行性高、成本低和效果好等特點，而且可以用于光合作用微生物細胞的改性，也能拓展到誘導其他類型微生物的功能轉變。

3.4.2 生物人工光合作用

隨著人類發展對可再生能源需求的增長，對太陽能的利用越來越引起大家廣泛的關注和重視[197-199]。光合作用是自然界利用太陽能最主要的形式，人工模擬光合作用一直以來都是科學家們的夢想。放氧的光合作用是地球上最主要的光合作用，也是對人類最為重要的，因為它不僅為人類的生存提供氧氣，還提供初級生產力。放氧的光合作用主要分成2個部分，在光反應階段光合系統分解水產生氧氣和電子；在暗反應階段電子參與二氧化碳還原固定過程最終生成碳水化合物。目前，光反應階段已能通過光催化和光電催化水分解實現，這個過程可以在放出氧氣的同時產生氫氣[198-201]。受到自然界光合反應過程的啟發，利用生物體系中的光合系統或者氫化酶與光催化納米材料復合互補，能夠實現更高效的光催化水分解。在暗反應階段，通過人工光合體系目前能夠實現二氧化碳的還原，但是只能得到低碳的產物，并且缺乏可控性和選擇性[202-204]。而在自然的光合作用中，暗反應的產物是具有選擇性 的[205-206]。因此，生物與人工光合體系的有機結合是一個可行的方案。Sakimoto等[90]通過硫化鎘納米顆粒對熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica）進行改造，使得這種非光合作用的細菌，能夠在可見光下，利用硫化鎘納米顆粒產生的光生電子在細胞內通過Wood-Ljungdahl途徑還原二氧化碳得到醋酸（圖18）。這項研究不僅對于生物人工光合體系的構建具有重要的指導意義，也拓展了納米材料在生物體改造中的應用。

最近，魏煒等[105]通過合成物學的手段構建了一種能在膜上表達重金屬螯合蛋白PbrR和在細胞內部表達[NiFe]氫酶的大腸桿菌（圖19）。硫離子先在大腸桿菌表面利用PbrR結合鎘離子，形成硫化鎘納米顆粒。硫化鎘納米顆粒作為一種常用的可見光響應的光催化材料，可以充當類似光合系統II（PSII）的角色，為細胞提供光生電子源。他們受到熊威等工作的啟發，通過仿生硅礦包裹，實現了大腸桿菌的聚集，并誘導了大腸桿菌聚集體在有氧條件下的光合產氫。這項工作利用合成生物學方法與納米技術，實現了對生物體的定向改造，為生物改造提供了新的思路。

3.5 環境保護

作為地球上主要的初級生產者，藍藻在地球上分布廣泛，并且對地球的大氣層和生態圈產生了深遠的影響[207-208]。但是藍藻的大量繁殖也會帶來嚴重的環境問題和健康威脅[209-210]。藻類的大量繁殖現象發生在淡水中稱之為水華，發生在海洋中則稱之為赤潮[211-212]。其中，藍藻水華是目前困擾全球最主要的水環境問題之一，并且發生率呈逐年上升的趨勢。藍藻水華爆發后，不僅會向水體中釋放藻毒素，嚴重危害動物和人類的健康，而且會使水體溶解氧迅速下降，破壞水生環境的生態圈，并由此引發一系列其他環境問題[213-214]。為了避免和減輕藍藻水華帶來的危害，人們發明了很多種策略。目前最常用的處理方法，一是使用化學殺藻劑和絮凝劑[215-216]，二是人工捕撈[217-218]。這兩種方法，前者缺乏生物選擇性，并會產生二次污染，給水環境帶來其他不利影響，而后者則需要消耗大量的人力和物力，成本太高。更重要的是，目前人們采用的處理藍藻水華的方法都主要集中在水華爆發后的處理，而并不能抑制藍藻水華的爆發。由于水體的富營養化是水華爆發的最重要因素之一，因此減少水域和沉積物中的磷負載量是目前最廣泛使用的方法，但是這種方法成本太高，也不適合大范圍應用。所以，開發更加安全有效的抑制藍藻水華爆發的方法對人類來說是一個巨大的挑戰。

圖18 （a）熱醋穆爾氏菌-硫化鎘復合體及其自光敏化太陽能轉化;（b）熱醋穆爾氏菌-硫化鎘復合體中太陽能-化學能轉化的可能途徑[90]Fig.18 （a）Depiction of the M.thermoacetica-CdShybrid system and self-photosensitization of it for solar-to-chemical conversion;（b）Possible pathway for solar-to-chemical conversion of the M.thermoacetica-CdShybrid system[90]

圖19 表面展示的生物復合技術誘導空氣環境中的光驅動產氫[105]Fig.19 Proposed surface-display biohybrid approach to light-driven hydrogen production in air[105]

自然界中的許多藍藻可以在細胞內部形成氣囊，這些氣囊可以幫助它們在水體中上浮以捕獲更多的太陽光[219-221],正是這些漂浮的藍藻在水面大規模集聚形成了水華。相比于藍藻，自然界中的硅藻的細胞壁由具有特殊結構的二氧化硅構成[222]。在自然界中，硅藻利用硅化的細胞壁作壓艙物[17,223]，使細胞保持沉在水底的狀態，在水底光照不足和溫度較低的條件中，硅藻細胞的光合生長也受到抑制，所以硅藻相比于其他微藻而言，生長較為緩慢，更不易爆發水華。受到這個現象的啟發，熊威等[104]以水華微囊藻(Microcystis spp.）為研究對象，模仿生物硅礦化的策略，在聚二甲基二烯丙基氯化銨（PDADMAC）的誘導下，實現了藍藻與二氧化硅納米顆粒的直接復合（圖20a），與二氧化硅復合后的藍藻迅速沉降到水底（圖20b），并延緩光合生長，從而抑制藍藻的大量繁殖和藻毒素的釋放（圖20c），并且水體中的氧濃度得以維持（圖20d）。此外，這個方法不僅對實驗室培養的微囊藻有效果，對太湖水以及野外現場試驗都有良好效果[104]。這項研究不僅為抑制水華爆發提供了一種全新的策略，對全球水環境和水資源的保護有重要意義，而且此項研究所采用的處理方法可簡便快速地誘導藍藻細胞的聚集沉降，亦有望應用于微藻細胞的富集，降低微藻生物能源的利用成本。

表1 納米材料改造生物體的方法及應用Table 1 Approaches and applications of modification of organisms by nanomaterials

綜上所述，表1列出了近年來納米材料改造生物體的一些成功案例。

續表1

圖20 （a）利用PDADMAC直接誘導二氧化硅納米顆粒與藍藻結合示意圖;（b）正常的藍藻處理后聚集的藍藻在燒杯中的分散狀態隨時間的變化;（c）正常的藍藻和聚集沉降的藍藻的細胞懸液中氧氣濃度的變化（n=5）;（d）正常的藍藻和聚集沉降的藍藻的細胞外微囊藻毒素濃度（n=5）[104]Fig.20 （a）Scheme of the direct incorporation of silica nanoparticles on the cyanobacteria using PDADMAC;（b）Native cells （before treatment）and aggregated cells in the beaker （100 mL）at different times,which demonstrated rapid sedimentation of the cells in the presence of silica and PDADMAC;（c）Oxygen concentration in the culture medium of native and aggregated cyanobacteria （n=5）;（d）Extracellular microcystin concentration of native and aggregated cyanobacteria （n=5）[104]

4 總結與展望

在漫長的生物進化過程中，生物體在自然選擇的作用下，漸漸學會了利用材料來改變自身的功能，去適應環境，進而邁向更高等的生命形式。進入21世紀以來，隨著生命科學的發展和納米技術的進步，受到自然進化過程的啟發，科學家們嘗試通過材料來改造生物的功能。經過近十年的研究和探索，仿生無機納米材料改造生物體在方法和應用上都取得了全面的進展，從研究者的數量和分布，文章的檔次和數量來看，這個領域已初具規模。目前，通過仿生礦化的手段實現生物體的納米材料改造是生物相容性最好的途徑之一，不過仿生礦化可選擇的材料種類僅限于磷酸鈣、碳酸鈣、二氧化硅等，而這些材料能夠賦予的功能有限。實現改造的生物體則涵蓋了病毒、原核微生物、真核微生物細胞、動物細胞等幾乎所有的生物體基本組成單元。對細胞的改造主要以酵母和大腸桿菌為模式生物居多，這些研究主要是探索改造方法和材料體系為主，應用主要是實現細胞保護。對病毒的改造，主要是集中在提高疫苗熱穩定性和病毒載體生物隱身性能方面，也屬于利用材料賦予生物保護的功能。對其他特定細胞的改造，比如微藻，紅細胞，癌細胞等，由于細胞自身的功能和特性，通過特定的納米材料可以賦予其相應的功能和應用。

盡管過去的10年，仿生無機納米材料改造生物體已經取得了重大的發展，并且這個領域的整體框架已初步形成，但是目前這個領域已經報道的研究還是處于初級探索階段，研究的思路主要是選擇材料與生物體結合并尋找新功能。接下來這個領域還需要在材料與生物體的結合方法，材料與生物體的作用機制以及新的功能與應用方面進行更廣泛的探索和更深入的探究。

（1）材料與生物體的結合方法:目前的仿生無機納米材料改造生物體的過程以及材料本身都會對生物體本身有損傷，因此納米材料的生物相容性和生物安全性是需要在今后的研究中改進和提高的。新的材料體系和結合方法是探索新功能和新應用的基礎，納米材料技術的進步是這個領域發展的重要驅動力。如果能實現納米材料在生物界面的可控形成與結合，將有助于實現對生物體的精準改造。

（2）材料與生物體的作用機制:雖然目前已經實現了對多種類型的不同生物體的納米材料改造，但是對于材料與生物的界面相互作用是否影響生物體，還缺乏深入的認識和理解。材料與生物體的作用機制是連接納米材料和生物功能的“橋梁”，是這個領域的核心科學問題。對于材料與生物體作用機制的進一步認知不僅可以指導材料與生物體結合方法的改進，也能預示新的功能和應用。

（3）新的功能與應用:縱觀這10年來仿生無機納米材料改造生物體的應用探索，我們可以發現，起初的應用都是基于納米材料對生物體的保護功能，而保護的功能有很多種，這也和自然界中大多數礦化外殼的功能類似。隨著改造方法和材料-生物體系的改變，逐漸發現了新的功能和應用，比如生物能源、環境保護、生物催化和癌癥治療等都是最近幾年才發現的應用前景。新的改造方法和新的生物體系是新功能探索的物質基礎，材料與生物體的作用機制是理論基礎，同時探索新的功能和應用也將促進對納米材料與生物體相互作用機制的研究。

總之，仿生無機納米材料改造生物體是一個涉及化學、材料、生物、醫學、環境等多學科相互交叉的研究領域，正引起越來越多的研究者關注和參與。過去10年的研究為這領域未來的發展打下了堅實的基礎。未來這個領域不僅在原有的基礎上還有進一步完善的空間，在新的方法、機制和應用方面更加具有廣闊的前景。

致謝:美國耶魯大學醫學院王廣川博士，浙江大學求是高等研究院王曉雨博士，中國醫學科學院蘇州系統醫學研究所周航宇博士，浙江理工大學材料與紡織學院趙瑞波博士提供相關引文圖片和寶貴建議。