缺血性腦卒中相關基因篩選和功能分析

胡瑞婷 覃冬華 胡瑞光 馮曉敏

(廣西壯族自治區民族醫院神經內二科，廣西 南寧 530001)

缺血性腦卒中缺血性腦卒中發病過程中伴隨著多個基因的改變，這些基因的表達上調或下調對疾病的發生、發展和轉歸起到重要的作用〔1，2〕。本文通過分析缺血性腦卒中發病時發生的基因改變，旨在分析該病的外周血基因表達譜，初步篩選出急性缺血性腦卒中發病過程中的起重要調控作用的基因。

1 資料與方法

1.1標本數據 從美國國家生物技術信息中心的Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“ischemic stroke”為檢索詞，檢索有關缺血性腦卒中的基因表達譜微列陣數據。納入排除標準：①數據集必須是全基因組的表達mRNA芯片數據；②數據是關于缺血性腦卒中患者和正常人外周血標本的結果；③每個數據集的標本量必須大于20個(例)。

1.2差異表達基因篩選 采用R3.2.0軟件和Bioconductor中的limma軟件包對下載的基因表達譜數據進行分析，先對數據進行標準化和Log2轉化，在采用t檢驗篩選差異表達基因。差異基因的選擇需同時滿足以下條件：①組間基因表達值比較P<0.05；②組間差異表達倍數(fold change)>1.0倍。

1.3基因功能注釋和信號通路分析 將獲得的差異表達基因輸入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具進行基因功能分析，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)三部分，再利用(DAVID)中(KEGG)工具對這些基因進行信號通路分析，以P<0.05為有顯著意義的基因功能或信號通路。

1.4蛋白-蛋白互作分析(PPI) 將差異表達基因輸入在線分析工具STRING10.0 (http：//www.string-db.org/) 對腦卒中發病相關基因表達產物構建PPI網絡，再使用STRING得到的PPI網絡數據輸入Cytoscape軟件進行可視化分析，再使用MOCDE插件分析出PPI網絡中的子網絡，根據每個基因在的網絡中的關聯系數顯示節點顏色深淺。

2 結 果

2.1標本信息 根據納入排除標準，檢索到2個GEO數據(GSE22255〔3〕和GSE16561〔4〕)共99個樣本，分別納入55個缺血性腦卒中患者外周血標本和44個健康對照人群外周血標本，患者均為發病時采集外周血標本。其中男47例，女52例，分別采用Affymetrix和Illumina芯片平臺檢測。兩個標本的基本資料見表1。

2.2差異表達基因篩選 以P<0.05，差異倍數>1倍為條件進行篩選，共得到61個差異表達基因，分別為：GSE22255得到40個差異表達基因，其中表達上調38個，下調2個；GSE16561得到21個差異表達基因，其中表達上調20個，下調1個；兩個樣本數據中差異表達前10個基因均為上調基因。見表2。

表1 納入標本的基本資料

表2 差異表達倍數前10個基因

2.3PPI 使用STRING10.0軟件將61個差異表達基因進行PPI，共得到44個節點及95條相互關系連接線，如圖1所示，人類白細胞抗原(HLA)-DRB1、肽?；彼崦搧啺访?PADI4)、IgG-Fc片段低親和力受體(FCGR)3B、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞因子信號抑制物(SOCS)3這5個基因與其他基因的關聯系數最高；根據MOCDE的計算結果得到一個子網絡，該網絡有10個基因，其中TNF是該子網絡的核心基因。

2.4基因功能注釋和信號通路分析 對兩個樣本的61個差異表達基因進行基因功能注釋和信號通路分析，結果GO基因功能注釋顯示這些差異表達基因主要參與炎癥反應、免疫反應、中性粒細胞趨化生物過程；主要分子功能為化學因子活性、蛋白結合、細胞因子活性等；KEGG通路顯示這些差異表達基因主要參與類風濕性關節炎通路、腫瘤壞死因子通路、Toll樣受體通路。見表3。

A：差異表達基因整體互作網絡圖，顏色越紅表示基因表達上調倍數越高，綠色表示表達下調；B：差異表達基因整體互作網絡中的子網絡圖圖1 缺血性腦卒中差異表達基因PPI圖

表3 基因功能和信號通路分析

3 討 論

缺血性腦卒中是由于局部血管梗死，相應供血區域血流灌注不足，從而導致肢體運動、感覺障礙等相關臨床癥狀的腦血管疾病〔5〕。調查顯示，43%～65%的腦卒中患者屬于缺血性腦卒中，是腦卒中的主要類型〔6〕。缺血性腦卒中與其他缺血性疾病類似，其發病過程是一個多基因、多步驟、多途徑、多階段相互作用和相互影響的復雜過程，這是導致該病治療困難，致殘率高、復發率高的重要原因〔7〕。因此，從分子水平揭示缺血性腦卒中的發病機制，成為該病治療的研究熱點〔8〕。生物基因芯片技術具有快速、高效、大規模、平行化地檢測基因表達的優勢，采用生物信息學方法分析疾病發生過程的基因表達變化，可以為我們更好地理解缺血性腦卒中的發病機制提供有益的線索〔4〕。

本文發現61個基因有較顯著的差異表達，提示這些基因可能參與了缺血性腦卒中的發病過程。本文發現HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3的相互作用在缺血性腦卒中發病中與其他差異表達基因關聯度最高，提示這個基因有可能在缺血性腦卒中的病變過程中其主要作用。在這5個基因中，HLA-DRB1、TNF、FCGR3B、 SOCS3與腦卒中的作用得到了驗證，如陳維等〔9〕報道HLA-DRB1單倍型與缺血性腦卒中的發生呈易感關聯，TNF和SOCS3在腦卒中發病中的作用已有較多的報道〔10，11〕，而尚未檢索到PADI4在腦卒中的作用報道，而且FCGR3B的報道也較少〔12〕，提示可以對PADI4和FCGR3B基因進行后續的基礎和臨床驗證研究。

目前國內尚未有文獻報道缺血性腦卒中患者外周血發病過程中差異表達基因的研究結果，本文首次報道了該結果。然而本文也存在不足之處，首先是研究的標本量較小，這與目前發表的數據有關，如果有更多的基因表達譜數據發表，則可以將其納入進一步分析。其次是本文只分析了缺血性腦卒中患者的結果，沒有對不同類型，如急性或慢性缺血性腦卒中患者，血管性或其他原因引起的腦缺血類型進行亞組分析，這些都是今后進一步的研究方向。

總之，缺血性腦卒中患者外周血發病過程有多個基因表達發生顯著改變，篩選出來的HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3等基因有望成為今后對缺血性腦卒中干預新的研究靶點。對這些基因在缺血性腦卒中的具體作機制還未明確，還需要進行更深入的實驗研究。