水稻稻曲病菌PCR快速檢測技術及應用

曾 蓉，徐麗慧，吳 雁，高士剛，劉 欣，戴富明

(上海市農業科學院生態環境保護研究所上海市設施園藝重點實驗室，上海201403)

稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌[Ustilasinoideavirens(Cooke)Tak]引起的一種穗部病害，是水稻上最常見的病害之一，發生遍布世界各水稻產區[1]。稻曲病菌有性階段為Villosiclavavirens(Cooke)Tak，侵染水稻后，能迅速充滿整個谷粒，致穎殼基部形成淺黃綠色的菌絲體小塊，后膨脹變為墨綠色或深褐色[2-3]。稻曲病能造成嚴重經濟損失，不僅導致水稻產量下降、品質變差，還能在稻粒上產生Ustiloxin-A等6種毒素，人畜誤食后會引起食品安全問題[4-6]。因此控制水稻稻曲病的發生，對我國的水稻品質及稻米生產安全顯得尤為重要。

目前，沈永安等[7]、Ashizawa等[8]認為土壤中攜帶稻曲病菌，自然越冬的厚垣孢子可作為初侵染源。然而，黎毓干等[1]、 陳永堅等[3]、劉見平等[9]認為種子帶菌是稻曲病的初侵染源，自然感染稻曲病菌的種子的萌發會受到抑制[10-11]。所以，當水稻種子混入稻曲病菌后，田間發生稻曲病的風險增加。本試驗建立了基于水稻稻曲病菌的特異性基因序列的PCR快速檢測方法，并對生產上的水稻種子進行了快速檢測應用，以期為上海市水稻稻曲病的監測預警和快速診斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：水稻稻曲病菌菌株由浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所王艷麗贈送。水稻上其他參考菌株包括禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、新月彎孢菌(Curvularialunata)、厚膜孢鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)，細極鏈格孢(Alternariatenuissima)、鏈格孢(Alternariaalternata)、平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)、草莖點霉(Phomaherbarum)、黑孢菌(Nigrosporasp)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、Epicoccumsorghinum，墨汁鬼傘(Coprinopsisatramentaria)等由本實驗室分離保存。

供試種子：上海生產上使用的水稻種子樣品(表1)。

表1 供試水稻種子樣品

試劑：Triton X-100，SDS，NaCl，Tris-HCl，EDTA等生化試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，Trans2K Plus II DNA Marker，瓊脂糖等分子生物試劑購自北京全式金生物技術有限公司； Quick-DNA PlantSeed購自北京天漠科技開發有限公司。

1.2 方法

菌絲DNA按照Bust n’Grab方法提取[12]；待測水稻樣品利用Quick-DNA PlantSeed試劑盒(ZYMO)提取。

從GenBank下載U.virens基因組和非冗余數據庫((non-redundant database，nr)，應用本地BLSATp把U.virens序列逐條與nr進行比對，E-value設置為1×10-10。獲得特異性基因，從中挑選出合適的基因并根據其核苷酸序列設計特異性引物。選取引物對UV-788F(GACGATGTTCTGTCCTGTGCG)和UV-788R(GGCTCTTGAAAGGCGTTATCTG)為本研究的擴增引物，擬擴增Accession No.為KDB11756基因部分片段，其包括內含子的序列大小約為788 bp。本研究還以胡茂林等[10]報道的特異性引物對UV279-F(CACACTCCGAAACCCCCCT)和UV693-R(CACATCATTTGCCCCCGTC)為參考，其擴增的目的片段為415 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 退火溫度優化及引物特異性

M：2k plus Marker； 1：55.0 ℃；2：55.7 ℃； 3：56.9 ℃； 4：58.8 ℃； 5：61.1℃； 6：63.0 ℃； 7：64.3℃； 8：65.0 ℃圖1 引物退火溫度試驗Fig.1 The optimum annealing temperatures of UV-788FUV-788R primers

M：2k plus Marker； 1：U.virens；2：F.graminearum； 3：C.lunata； 4：F. chlamydosporum； 5：A.tenuissima； 6：A. alternate； 7：B.sorokiniana； 8：P. herbarum； 9：Nigrospora sp.； 10：R.solani； 11：F.moniliform； 12：E.sorghinum； 13：C.atramentaria；-：健康水稻種子圖2 引物特異性試驗Fig.2 Primers specificity analysis of U.virens assay

2.2 檢測靈敏度

M：2k plus Marker； 1—11：200 ng—200×10-10 ng按1∶10梯度稀釋的11個DNA濃度模板；-：健康水稻種子；A：引物對UV-788FUV-788R； B：引物對UV279-FUV279-R圖3 PCR檢測靈敏度Fig.3 Sensitivity analysis for the detection of U.virens

2.3 種子樣品的檢測

以上海郊區水稻生產上使用的水稻種子樣品為檢測對象，利用引物對UV-788FUV-788R檢測種子水稻稻曲病的帶菌情況。PCR結果顯示被檢測的38個水稻樣品中有13個樣品顯示為陽性，其余為陰性，部分結果如圖4所示。

M：2k plus Marker； 1—22：1—22號種子樣品；-：健康水稻種子；+：U.virens DNA陽性對照圖4 種子樣品的PCR檢測Fig.4 PCR detection method application on rice seed

3 討論

病原真菌的準確鑒定和早期檢測是植物病害防治的基礎。對于有些難于分離和純化的真菌病害，傳統的分離、檢測等不能在菌侵染初期作出快速準確檢測，而分子生物學檢測技術可以對病菌進行早期診斷及預警，從而可以有效抑制病原菌的傳播與病害流行。

真菌的rDNA的ITS(Internal Transcribed Spacer)序列由于其保守性和種特異性，已被廣泛的應用于病原菌的鑒定及檢測中。但是，ITS序列的保守性往往導致不能特異的區分和鑒定病原物，故利用ITS序列設計引物困難。本研究應用生物信息學方法，對水稻稻曲病菌的全基因組與nr數據庫進行比對分析，獲得該病原菌的特異性基因后，設計特異性引物用于檢測，避免了假陽性的可能。

本研究主要目的是建立水稻種子中稻曲病菌的PCR檢測技術，并將其應用于田間或市售種子的檢測，最終應用于病害的監測及預警。周永力等[13-14]基于稻曲病菌ITS序列設計了巢式PCR引物，可用于稻曲病菌定性研究。林廷邦[15]也建立了水稻稻曲病PCR和巢式PCR的檢測方法，應用于水稻植株和種子的帶菌檢測。鄭靜等[16]建立了水稻稻曲病的熒光定量PCR檢測方法，理論上最低可檢出24 fg的基因組DNA模板量及0.67個分生孢子。巢式PCR和熒光定量PCR檢測方法都能十分靈敏的用于病原菌的檢測，但巢式PCR有著耗時及易污染的弱點，熒光定量PCR也受限于昂貴的實驗設備。本研究建立的水稻稻曲病常規PCR檢測方法，為一種特異、靈敏、高效、經濟的檢測方法，為水稻稻曲病菌的檢測及種業健康發展提供了技術支持。