二氧化氯對(duì)果膠桿菌(P.carotovorum subsp.carotovorum)抑制效果的研究

喬勇進(jìn)，甄鳳元，劉晨霞，高春霞，王 曉

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200235 )

果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一種危害廣泛的植物病原菌，能夠侵染白菜類(lèi)蔬菜、馬鈴薯、胡蘿卜、洋蔥、辣椒、大蒜、人參、君子蘭、魔芋、郁金香、馬蹄蓮等植物[1]，破壞力強(qiáng)，危害較大。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)果膠桿菌的致病機(jī)理以及抑制方法研究較少。二氧化氯是國(guó)際上公認(rèn)的最新一代的高效、廣譜、安全的殺菌劑和保鮮劑，具有適應(yīng)面廣、使用劑量低、效果好、反應(yīng)快、無(wú)毒、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，但是二氧化氯對(duì)果膠桿菌的抑制研究鮮有報(bào)道。

果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可以破壞植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分解利用植物細(xì)胞和組織內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分，引起細(xì)胞死亡[4]。本試驗(yàn)采用二氧化氯處理果膠桿菌，研究二氧化氯溶液對(duì)果膠桿菌活力以及致病相關(guān)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)由自然發(fā)病的杭白菜軟腐病病斑上篩選分離得到，純化后于4℃保存，備用。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)(752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

二氧化氯(食品級(jí))及其他試劑(分析純)在國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司購(gòu)買(mǎi)。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，用蒸餾水定容至1 000mL，滅菌后備用。

LB固體培養(yǎng)基：依照LB液體培養(yǎng)基，每1.0 L再加入15g瓊脂，滅菌后備用。

細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：參照Marcus L等[5]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

(2)取二氧化氯母液和無(wú)菌水分別配制濃度為1.01 mgL、4.03 mgL、7.02mgmL的二氧化氯溶液，備用。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：按照表1，分別將試劑加好后搖勻，冷卻至室溫后定容至25 mL，540nm下測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作方法與還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法相同。

1.2.2 二氧化氯溶液對(duì)果膠桿菌的處理方法

1.2.2.1 果膠桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

參照李淑英等[6]的方法進(jìn)行。將50個(gè)錐形瓶裝的LB液體培養(yǎng)基平均分為五組，編碼為A、B、C、D、E組(每組10個(gè)平行)，分別加入100μL菌懸液，其中A、B、C、D和E五個(gè)處理組再分別加入0 mL、1.28 mL、2.63 mL、4.05 mL和5.56 mL的二氧化氯母液，于25℃下振蕩培養(yǎng)，2h后取出各組的1號(hào)錐形瓶即A1、B1、C1、D1、E1放置于4℃冰箱，隨后每隔2h按各組編號(hào)從小到大依次取出錐形瓶并放入冰箱，待培養(yǎng)20 h后測(cè)定OD值。

1.2.2.2 果膠桿菌存活率的測(cè)定

將1.2.2.1中培養(yǎng)20 h后的菌懸液分別稀釋至原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4，吸取10-3、10-4菌懸液100.0μL，涂布平板，靜置10min后于恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)36 h，記錄平板上的細(xì)菌總數(shù)，按照公式(1)計(jì)算細(xì)菌存活率。

(1)

1.2.2.3 果膠桿菌細(xì)胞膜透性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[7]，取培養(yǎng)3d的菌液10mL在4℃下離心，棄去上清液后，用吸水紙吸取菌體表面的水分，各取1g，離心后菌體放入含有0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL四種濃度二氧化氯的錐形瓶中，用電導(dǎo)儀測(cè)定溶液電導(dǎo)率記，為C0，然后在100 rmin、25 ℃震蕩培養(yǎng)，分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 測(cè)定菌體浸出液的電導(dǎo)率，記為Ct。測(cè)完后，將所有三角瓶放置于沸水中煮沸15 min，以殺死菌體細(xì)胞，待冷卻至25 ℃后再次測(cè)定各電導(dǎo)率值，記為C。根據(jù)公式(2)計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率值(%)，用相對(duì)電導(dǎo)率表示菌體細(xì)胞膜的通透性。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)平行。

(2)

式中：C0-0min時(shí)測(cè)定的的電導(dǎo)率值；Ct-各時(shí)間測(cè)定的電導(dǎo)率值；C-煮沸后測(cè)定的電導(dǎo)率值。

1.2.2.4 細(xì)胞壁降解酶活力的測(cè)定

(1)果膠酶(PG)活力測(cè)定

取0.5%果膠1.9mL，50℃的條件下預(yù)熱10min，加0.1mL酶液，50℃條件下反應(yīng)30min，加入1.5mL DNS(3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid)，沸水浴5min，定容至25mL，測(cè)定540nm下波長(zhǎng)。

(2)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活力測(cè)定

取1%果膠1.5mL，30℃的條件下水浴30 min，加入0.5 mL酶液，在30℃的條件下反應(yīng)30 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，定容至25 mL，測(cè)定540 nm下波長(zhǎng)。

(3)甲基纖維素酶(CX)活力的測(cè)定

取0.51%羧甲基纖維素(CMC)溶液1.5mL，50℃預(yù)熱10min后，加入0.5mL酶液，50℃的條件下，反應(yīng)30min，加入1.5mL DNS，沸水浴5min，定容至25mL，測(cè)定540nm下波長(zhǎng)。

(4)β-葡萄糖苷酶(GLU)活力測(cè)定

1.2.2.5 果膠桿菌致病力的測(cè)定

取杭白菜葉柄基部切4 cm左右的莖段，75%酒精擦拭消毒，下襯一張無(wú)菌濾紙，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并加入2.0 mL無(wú)菌蒸餾水保持濕度。用滅菌小刀在其中心劃2 mm×2 mm的十字型傷口，深度為1.5 mm 左右，取10 μL的經(jīng)不同濃度二氧化氯氣體處理、濃度為105個(gè)mL果膠桿菌菌懸液加入十字形傷口處，重復(fù)5次。用封口膜將培養(yǎng)皿封口于25℃培養(yǎng)。每隔3 h觀(guān)察其發(fā)病情況，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，每組20個(gè)平行處理，并按公式(3)計(jì)算發(fā)病率。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

生長(zhǎng)曲線(xiàn)是反映微生物總量隨時(shí)間變化的過(guò)程，可以看出微生物對(duì)培養(yǎng)基適應(yīng)的快慢程度以及對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況[8-9]。如圖1所示，二氧化氯對(duì)果膠桿菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且隨著二氧化氯濃度的升高，抑制效果明顯加強(qiáng)。在培養(yǎng)14h后，0.75 mgL、1.0mgL組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨于穩(wěn)定，0.25mgL、0.5mgL組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)雖然有小幅度的上升，但與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。在培養(yǎng)20h后，0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL的二氧化氯對(duì)果膠桿菌的抑制率分別為17.9%、26.4%、45.9%、66.6%，其中1.0mgL組的抑制效果最佳。

2.2 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌存活率的影響

細(xì)菌的存活率能夠反映外界環(huán)境條件對(duì)活細(xì)菌比例影響。如圖2所示，隨著二氧化氯濃度的升高果膠桿菌的存活率逐漸降低，且各處理組之間差異性顯著(P<0.05)，說(shuō)明二氧化氯對(duì)果膠桿菌有致死作用。1.0mgL組的細(xì)菌存活率只有對(duì)照組的17.18%。

圖1 不同二氧化氯濃度對(duì)果膠桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on growth of pectobacterium

注：不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan差異顯著性檢測(cè)不同處理組在0.05水平差異顯著(n=10)，下同圖2 不同二氧化氯濃度對(duì)果膠桿菌存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onsurvival rate of pectobacterium

圖3 不同二氧化氯濃度對(duì)細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onpermeability of cell membrane

2.3 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌細(xì)胞膜滲透率的影響

如圖3所示，不同濃度的二氧化氯溶液對(duì)果膠桿菌細(xì)胞膜滲透性的破壞程度不同。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的細(xì)胞膜滲透率均呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢(shì)。細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率的變化主要在前30min，之后，對(duì)照組、0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL處理組的細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率趨于穩(wěn)定，而1.0mgL處理組的細(xì)胞膜滲透率繼續(xù)增加，于120min后趨于穩(wěn)定。表明高濃度的二氧化氯處理能夠作用于果膠桿菌的細(xì)胞膜，破壞其選擇滲透性，影響細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.4 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌果膠酶活性的影響

果膠酶是指分解果膠的一種多酶復(fù)合物，腐敗菌通過(guò)分泌PG破壞寄主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其能夠吸收寄主的營(yíng)養(yǎng)寄生[10-11]。如圖4所示，在培養(yǎng)過(guò)程中，PG活性呈現(xiàn)先迅速升高后趨向平穩(wěn)，最后下降的趨勢(shì)。3d時(shí)，各組的PG活性達(dá)到峰值，對(duì)照組最大，為21.5 U，而0.25 mgL、0.5 mgL、0.75 mgL和1.00 mgL組的果膠酶活性分別為19.3 U、16.4 U、14.9 U和9.7 U，說(shuō)明二氧化氯處理能夠顯著抑制果膠桿菌產(chǎn)生的PG活性。

聚甲半乳糖醛酸酶是屬于果膠酶系的一種能夠催化果膠分子多聚α-(1,4)-聚甲半乳糖醛酸的裂解酶。在果膠桿菌的致病過(guò)程中可以起到分解寄主表皮細(xì)胞中果膠的作用[12-13]，如圖5所示，PMG活性曲線(xiàn)與PG曲線(xiàn)趨勢(shì)相似，均在第3天達(dá)到峰值，且各個(gè)二氧化氯處理組的PMG活性顯著(P<0.05)低于對(duì)照組，僅為對(duì)照組的88.7%、76.7%、61%和32.6%。

培養(yǎng)后期，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，PG、PMG活性迅速下降。

圖4 不同二氧化氯濃度對(duì)PG活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PG activity

圖5 不同二氧化氯濃度對(duì)PMG活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PMG activity

2.5 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌纖維素酶活性的影響

聚甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶都是纖維素酶系中的一種，能夠降解纖維素，是植物病原菌所分泌的重要致病因子，在植物的致病過(guò)程中分解植物表皮細(xì)胞的纖維素，引起細(xì)胞壁損傷以及組織浸解[14-15]。如圖6所示，在整個(gè)培養(yǎng)期間，CX活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，峰值在第4天，晚于PG、PMG，且活性較低，1 mgL二氧化氯組的CX活性?xún)H為對(duì)照組的30.4%。之后，隨著二氧化氯濃度的升高，酶活性顯著(P<0.05)降低，說(shuō)明二氧化氯能夠有效抑制CX活性，且與濃度呈正相關(guān)。

如圖7所示，GLU活性的變化趨勢(shì)與CX相同，均在第4天達(dá)到峰值，其中對(duì)照組的GLU活性為0.77U， 0.25 mgL、0.50 mgL、0.75 mgL、1.00 mgL組的GLU活性分別為0.63 U、0.55 U、0.46 U、0.21 U。之后，隨著二氧化氯濃度的升高降低，說(shuō)明二氧化氯處理能夠抑制GLU活性，其中1.00 mgL處理組的抑制效果最佳。

圖6 不同二氧化氯濃度對(duì)CX活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on CX activity

圖7 不同二氧化氯濃度對(duì)GLU活性的影響Fig.7 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on GLU activity

二氧化氯質(zhì)量濃度∕mg·L-1時(shí)間∕h81420263238CK12.3 d18.7 e25.3 e32.3 e39.7 e49.7 e0.148.7 c14.7 d20.7 d27.3 d33.7 d40.7 d0.574.7 b8.0 c12.0 c16.0 c21.7 c28.7 c1.00 0.0 a 4.3 b6.7 b11.3 b14.7 b18.3 b

2.6 不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌致病力的影響

杭白菜的發(fā)病率是衡量果膠桿菌致病力強(qiáng)弱的主要指標(biāo)。從二氧化氯氣體處理杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑和發(fā)病率情況可以看出，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL均能抑制杭白菜軟腐病的發(fā)生，對(duì)照組處理的杭白菜在接種20 h后，其莖段病情指數(shù)達(dá)到100%，病斑直徑為25.3 mm，到第38小時(shí)其病斑直徑為49.7 mm，而此時(shí)，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL處理組的病斑直徑分別為40.7 mm、28.7 mm、18.3 mm，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(表2)，說(shuō)明二氧化氯氣體對(duì)果膠桿菌的抑制作用隨著濃度的升高逐漸增大。接種后38 h發(fā)病情況如圖8所示，0.14 mgL、0.57 mgL處理組病情指數(shù)分別為80.0%、65.0%；1.00 mgL處理組杭白菜莖段在接種后14 h開(kāi)始發(fā)病，在第38小時(shí)其病情指數(shù)為55.0%，說(shuō)明二氧化氯氣體處理對(duì)果膠桿菌的抑制效果與其濃度呈正相關(guān)。

圖8 第38小時(shí)不同處理組杭白菜的病情指數(shù)Fig.8 At the 38th hour，the cabbage disease index of different treatment groups

3 結(jié)論與討論

二氧化氯作為一種新型廣譜、高效、環(huán)保的殺菌劑，近些年已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品抑菌防腐保鮮行業(yè)。其應(yīng)用于殺菌的機(jī)理主要是其具有強(qiáng)氧化性，可以穿透細(xì)胞膜，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性從而破壞細(xì)菌細(xì)胞的物質(zhì)交換，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制。Wang等[16]用二氧化氯處理蠶微孢子蟲(chóng)孢子后，蛋白質(zhì)、多糖、鉀離子、鈣離子從細(xì)胞中漏出，導(dǎo)致孢子因細(xì)胞膜透性增加，失去活性。二氧化氯液體處理組中，1.00 mgL處理組的浸提液中可溶性蛋白的含量0.93 mgg，說(shuō)明二氧化氯氣體處理可以破壞果膠桿菌細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白滲出，影響細(xì)菌細(xì)胞正常生理功能，從而抑制果膠桿菌的生長(zhǎng)。微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以直觀(guān)地顯示其生長(zhǎng)規(guī)律，反應(yīng)微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)程度以及對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況。本研究加入二氧化氯溶液后，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度明顯下降，且隨著濃度的增大，抑制效果愈明顯。Boddie等[17]利用二氧化氯處理牛乳，可以減少其中80%—90%的奧利斯葡萄狀球菌和鏈球菌，在牛初乳中加入0.5%的二氧化氯溶液，可三個(gè)月不霉變，延長(zhǎng)貯藏期。本試驗(yàn)中，1.00mgL二氧化氯處理果膠桿菌后，其存活率降低為17.18%，說(shuō)明二氧化氯具有使用劑量低且高效的優(yōu)勢(shì)，與前人的研究結(jié)果一致。

果膠桿菌是白菜類(lèi)蔬菜軟腐病的主要致病菌，其寄主范圍廣泛，侵染能力較強(qiáng)。目前對(duì)于果膠桿菌的致病機(jī)理國(guó)內(nèi)外都有研究，果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可以破壞植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分解利用植物細(xì)胞和組織內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分，引起細(xì)胞死亡。田紅炎等[18]等使用 60 mgL 二氧化氯溶液浸泡處理受損后獼猴桃20 min，可以顯著降低其腐爛指數(shù)。本研究將果膠桿菌菌懸液接種于損傷杭白菜莖段，發(fā)現(xiàn)杭白菜軟腐病的發(fā)病情況與前人研究一致，首先，損傷組織被侵染發(fā)病，隨后病斑不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致組織水浸腐敗。試驗(yàn)結(jié)果顯示，二氧化氯氣體處理對(duì)杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑的擴(kuò)展以及發(fā)病率有一定的抑制作用，經(jīng)二氧化氯氣體處理后的果膠桿菌，其病斑擴(kuò)展速度比對(duì)照組擴(kuò)展速度慢；1.00 mgL二氧化氯氣體濃度以上的處理組，接種14 h后發(fā)病，從果膠桿菌接種到發(fā)病的時(shí)間顯著延長(zhǎng)，說(shuō)明二氧化氯氣體處理對(duì)果膠桿菌的致病力有一定的抑制作用。Kan[19]研究指出，細(xì)胞壁降解酶可以降解細(xì)胞壁多糖，破壞細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體失去原有的支持力，引起細(xì)胞膜變形破裂，使寄主死亡。本研究發(fā)現(xiàn)二氧化氯可以抑制果膠酶系、纖維素酶系等細(xì)胞壁降解酶的活性，從而降低了果膠桿菌的致病性，說(shuō)明二氧化氯在抑制果膠桿菌的致病性方面有很好的效果。