植物線粒體巰基亞硝基化修飾蛋白質組學研究進展

張秋楠, 喻娟娟,2, 秦 智, 戴紹軍*

(1.上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234;2.東北林業大學 鹽堿地生物資源環境研究中心,黑龍江 哈爾濱 150040)

0 引 言

一氧化氮(NO)參與植物種子萌發、根生長、氣孔運動、開花等多種生物學過程的調節,在植物脅迫應答過程中也具有重要作用[1].NO通過參與調節蛋白質S-亞硝基化、金屬亞硝基化和酪氨酸硝化等過程影響蛋白質的功能.其中,蛋白質S-亞硝基化是NO與蛋白質半胱氨酸(Cys)殘基共價連接形成S-亞硝基硫醇(-SNO)的過程.蛋白質S-亞硝基化會影響其結構、活性、亞細胞定位,以及與其他蛋白質相互作用等[2].

線粒體在依賴S-亞硝基化的NO信號通路中起關鍵作用.線粒體是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成的重要場所,并參與凋亡信號轉導.線粒體中含有大量的硫醇和過渡金屬,為-SNO的生成提供了場所.此外,在線粒體豐富的膜系統中容易積累親脂性分子,如NO,因此成為植物中NO作用的主要靶細胞器.例如,NO可與復合物IV(細胞色素c氧化酶)的雙核CuB/血紅素a3位點結合,從而抑制該酶的活性[3].

迄今為止,研究者們應用蛋白質組學技術對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、酸橙(Citrusaurantium)、芥菜(Brassicajuncea)和落地生根(Kalanchoepinnata)的葉片和幼苗應答各種脅迫(如S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO,細胞內NO的主要存在形式)、H2O2、低溫、鹽和干旱脅迫)的S-亞硝基化蛋白質進行了分析[4-13].其中,多種植物線粒體S-亞硝基化蛋白質參與調控光呼吸、三羧酸循環、氧化磷酸化、活性氧分子(ROS)穩態、蛋白質加工與周轉,以及物質代謝等過程.

1 S-亞硝基化調節光呼吸相關酶的活性

NO可通過調控線粒體光呼吸相關酶的活性來調節光呼吸代謝.在線粒體中,二分子甘氨酸(Gly)在甘氨酸脫羧酶復合體(GDC)和絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)作用下生成絲氨酸(Ser).這一步可分為2個反應:一分子Gly可被GDC脫羧生成N5,N10-亞甲基四氫葉酸(m-THF),釋放CO2和NH3;另一分子Gly在SHMT作用下,與m-THF反應生成Ser.GDC由含硫辛酰胺輔基的H蛋白,含磷酸吡哆醛輔基的P蛋白,含四氫葉酸的T蛋白和L蛋白組成.蛋白質組學結果表明:GDC-H蛋白在用物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO[10]處理過的懸浮培養細胞中,發生S-亞硝基化修飾,并且在4 ℃下處理過的擬南芥葉片中亞硝基化程度增加(圖1)[12].PALMIERI等[3]發現在用物質的量濃度為1 mmol·L-1GSNO處理過的擬南芥葉片中,GDC-H1、GDC-P1和GDC-P2這3個亞基都被鑒定為S-亞硝基化靶蛋白.此外,研究表明氧化還原劑可調節植物葉片和離體線粒體中的GDC活性,也證實NO可抑制GDC活性,并且該過程與GDC脫羧亞基的幾個Cys殘基的S-亞硝基化和谷胱甘肽化密切相關.此外,GDC活性的抑制與擬南芥應答細菌激發子超敏蛋白的相關反應直接相關,并且這種抑制能夠激活氧化還原應答機制,從而引發線粒體紊亂和細胞死亡[3].該結果表明線粒體中的NO和ROS之間存在相互關聯,并且在植物應答脅迫過程中發揮重要作用.

在用物質的量濃度為1 mmol·L-1GSNO處理過的擬南芥葉片中,SHMT也發生了S-亞硝基化修飾[3].由此可知,NO可通過調節GDC和SHMT的S-亞硝基化水平來影響Gly轉化為Ser的過程,進而影響光呼吸代謝.

圖1 S-亞硝基化蛋白質組學研究揭示的植物線粒體NO信號調控網絡.縮寫:CBS,胱硫醚β-合酶;Cpn,分子伴侶;DLDH,二氫硫辛酰胺脫氫酶;GDC,甘氨酸脫羧酶;GDH,谷氨酸脫氫酶;Hsp,熱激蛋白;IPMDH,3-異丙基蘋果酸脫水酶;MDH,蘋果酸脫氫酶;Mn-SOD,錳超氧化物歧化酶;Prx,過氧化物氧化還原酶;SDH,琥珀酸脫氫酶;SHMT,絲氨酸羥甲基轉移酶;SUCA2,琥珀酰-CoA合成酶

2 S-亞硝基化修飾調控三羧酸循環

線粒體中的三羧酸循環能為植物生長發育和逆境應答提供能量.在此過程中,草酰乙酸(OAA)與乙酰CoA結合,在一系列酶的催化作用下重新生成OAA,并釋放CO2和還原當量(圖1).順烏頭酸酶(ACO)可催化檸檬酸轉變為異檸檬酸.蛋白質組學研究發現,擬南芥懸浮培養細胞中的ACO在經物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后發生S-亞硝基化修飾[10].ACO是動物體內主要的NO靶蛋白,動物細胞質ACO可作為關鍵的氧化還原傳感器,還可被NO轉化為一種mRNA結合蛋白.與動物ACO類似,煙草(Nicotianatabacum)ACO的酶活性也可被NO所抑制,并且煙草細胞質ACO(NtACO1)也可以通過IRP-1參與mRNA的結合,這說明植物與動物體內的NO調控ACO功能的機制很相似[14].

琥珀酰-CoA合成酶(SUCA)能催化琥珀酰-CoA和琥珀酸的可逆反應,是三羧酸循環中唯一的底物磷酸化反應.琥珀酸脫氫酶(SDH)能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸.在NO過剩突變體(noe1)水稻植株中發現,SUCA2發生亞硝基化修飾[9];在干旱處理4 d的敏感基因型小麥中,SDH的亞硝基化水平增加[7].

線粒體蘋果酸脫氫酶(MDH)能催化L-蘋果酸脫氫變成OAA,這也是三羧酸循環中的重要步驟.在GSNO處理的擬南芥懸浮培養細胞中,MDH發生S-亞硝基化修飾[3,10];在noe1水稻植株中,MDH的S-亞硝基化程度也增加[9].NO供體可抑制MDH的活性[11].這表明:NO導致MDH發生S-亞硝基化,從而抑制MDH的活性.由此可見,三羧酸循環相關酶的S-亞硝基化可能影響相關反應中間物的生成,從而調控能量代謝以應答逆境.

3 S-亞硝基化影響氧化磷酸化過程

植物細胞代謝時所脫下來的氫可由線粒體呼吸鏈傳遞并釋放能量,同時偶聯驅動ATP合成酶生成ATP,為植物生長發育提供能量.線粒體氧化呼吸鏈中的鐵硫蛋白和NAD(P)H泛醌氧化還原酶分別在水稻noe1突變體和干旱處理4 d的小麥中發生S-亞硝基化修飾.在用物質的量濃度為1 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥葉片[3]和低溫處理4 h的擬南芥幼苗中[12],線粒體ATP合成酶α亞基的S-亞硝基化程度增加;在干旱處理4 d的小麥植株[7]和低溫處理4 h的擬南芥幼苗中[12],ATP合成酶β亞基的亞硝基化水平也上升.此外,植物線粒體ATP合成酶α和β亞基在硫氧還蛋白(Trx)互作蛋白質組學研究中都被鑒定為Trx靶蛋白[15].這表明:線粒體ATP合成酶的功能受其亞基的氧化還原狀態調節.

4 S-亞硝基化調控ROS穩態

植物線粒體中的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、抗壞血酸-谷胱甘肽循環酶和Trx/過氧化物氧化還原酶(Prx)系統相關酶等對于維持ROS穩態具有重要作用.SOD是植物細胞抗氧化系統的第一道防線,可催化超氧陰離子自由基(O2?-)歧化生成過氧化氫(H2O2),從而有效降低細胞內O2?-過量積累所造成的傷害.Mn-SOD是一種活性中心含錳金屬輔基的SOD,在保護線粒體免受O2?-損傷的過程中發揮重要作用.在經NO供體硝普鈉(SNP)預處理后再經物質的量濃度為150 mmol·L-1的NaCl處理16 d的酸橙葉片中,Mn-SOD的亞硝基化水平增加[16].

Prx是一種巰基依賴性非血紅素過氧化物酶,可解毒多種不同類型的過氧化物(如H2O2),對線粒體內的氧化還原平衡穩態起重要作用.研究發現:在用物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養細胞中,線粒體Prx IIF發生S-亞硝基化修飾[10].與此類似,在丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato,PST)侵染擬南芥時,葉綠體Prx IIE的S-亞硝基化水平上升[13].此外,Prx IIE具有ONOO-還原酶活性,其Cys121的體外S-亞硝基化可導致該酶活性喪失.Prx IIE的S-亞硝基化可導致蛋白質酪氨酸硝化的增加,這表明Prx IIE在控制植物ONOO-內源水平的過程中發揮著關鍵作用[17].

5 S-亞硝基化調控蛋白質加工與周轉

維持蛋白質的正確構象,防止錯誤折疊蛋白質的聚集,對于植物在逆境脅迫條件下的存活至關重要.分子伴侶(Cpn)和熱激蛋白(Hsp)有利于穩定蛋白質和細胞膜系統,促進蛋白質的重新折疊,并防止蛋白質的聚集[18].蛋白質組學研究發現多種Cpn和Hsp的S-亞硝基化水平在脅迫條件下發生變化.在經物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養細胞中,Cpn10和Hsp60發生S-亞硝基化修飾[10].此外,在GSNO處理的落地生根(Kalanchoepinnata)葉片中,Hsp90的亞硝基化水平增加[5].這表明S-亞硝基化可能通過調節Cpn和Hsp的結構與功能應答逆境脅迫.

6 S-亞硝基化影響多種物質代謝

植物線粒體的谷氨酸脫氫酶(GDH)催化α-酮戊二酸與NH4+合成谷氨酸,這是除谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環途徑之外的另一種NH4+同化途徑.植物逆境應答與衰老過程中,體內容易積累過量的NH4+,GDH可在緩解植物NH4+中毒過程中發揮作用.在用物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養細胞中,GDH2的S-亞硝基化水平增加[10].此外,在Pst侵染24 h的耐性基因型(PtoR)番茄(Solanumlycopersicum)中,GDH的氧化水平升高[19].GDH也被鑒定為Trx和谷氧還蛋白(Grx)靶蛋白[15,20].這些意味著NO可能通過調控GDH的氧化還原狀態,調控細胞內的NH4+穩態.

3-異丙基蘋果酸脫水酶(IPMDH)可催化亮氨酸生物合成中的氧化脫羧步驟和硫代葡萄糖苷的甲硫氨酸鏈延長.水稻noe1突變體中IPMDH2的S-亞硝基化程度增加.IPMDH已被報道為氧化還原調節酶,番茄抗性品種和油菜保衛細胞中的IPMDH1,以及擬南芥懸浮培養細胞中的IPMDH2在應答Pst、茉莉酸甲酯和H2O2處理時氧化水平分別上升[19,21].油菜和擬南芥中IPMDH1的活性受氧化劑(如H2O2和CuCl2)和還原劑(如二硫蘇糖醇(DTT)和Trxm)的調節,且還原型IPMDH1的活性更高[21].這表明:IPMDH的功能可能受氧化還原系統的調節.

二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH)屬于黃素蛋白氧化還原家族,是組成線粒體基質中的丙酮酸脫氫酶復合體、支鏈氨基酸-脫氫酶復合物,以及GDC的必需組成成分.研究發現:在GSNO處理的擬南芥[3]和馬鈴薯(Solanumtuberosum)葉片中[8],以及應答NaCl脅迫的擬南芥懸浮培養細胞[6]和低溫處理的擬南芥幼苗中[12],DLDH1和DLDH2的S-亞硝基化水平均上升.這表明NO通過調節DLDH的S-亞硝基化水平影響其功能.

胱硫醚β-合酶(CBS)參與轉硫代謝,可催化絲氨酸和同型半胱氨酸合成胱硫醚.在用物質的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養細胞中,CBS發生S-亞硝基化修飾[10].這表明NO可通過調節代謝過程關鍵酶的S-亞硝基化水平,從而影響代謝物的生物合成過程.

7 結 語

蛋白質S-亞硝基化修飾在植物線粒體中發揮了重要作用.蛋白質組學研究發現了植物線粒體中多種S-亞硝基化蛋白,它們參與線粒體中光呼吸、三羧酸循環、氧化磷酸化、ROS穩態、蛋白質加工與周轉,以及物質代謝等過程(圖1).這表明NO可通過調節蛋白質的S-亞硝基化水平調控多種信號與代謝途徑.今后,隨著蛋白質S-亞硝基化鑒定技術的發展,可以開展S-亞硝基化蛋白的定量分析,為理解植物體內NO調控網絡提供更有價值的信息.