厭氧發酵反應器的啟動運行及活性污泥的優勢菌群分析

王靖媛, 秦 智, 尹 夢

(上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234)

0 引 言

兩相厭氧處理系統中,產酸相反應器的運行不僅能利用活性污泥中微生物的代謝活動處理高濃度有機廢水,將大分子有機物降解為乙醇、乙酸和丁酸等小分子物質,還可在分解廢水污染物的同時使反應器產生氫氣.氫氣作為21世紀最具有發展潛力的清潔能源,對改善以石化燃料為主的能源結構,實現社會環境協調發展起著重要作用.兩相厭氧生物處理系統中產酸相效能的高低直接影響著整個工藝系統的處理能力和運行的成敗.

厭氧發酵技術在許多發達國家應用廣泛[1].楊景亮等[2]利用兩相厭氧工藝處理含高濃度硫酸鹽的廢水,獲得較好的效果.李建政等[3]對兩相厭氧反應器中產酸相反應器的快速啟動以及污泥馴化進行研究,結果表明:在接種污泥質量濃度不少于6.5 g·L-1,并控制進水化學需氧量(COD)、水力停留時間(HRT)和pH值的情況下,可在20 d內完成產酸相的快速啟動,并可在45 d左右實現對乙醇型發酵菌群的馴化.班巧英等[4]利用厭氧折流板反應器(ABR)馴化污泥,并考察系統中產甲烷菌群的空間分布特征,證實了ABR中產甲烷菌的多樣性明顯高于產氫/產乙酸菌,當反應器受到沖擊時,產氫/產乙酸作用更容易成為限速步驟.胡小兵等[5]利用序列間歇式活性污泥法反應器(SBR)培養馴化階段的活性污泥,證實活性污泥培養馴化是微型動物群落物種多樣性水平增高后趨于穩定的過程.于鳳慶等[6]在研究膜生物反應器(MBR)啟動運行階段的活性污泥馴化過程中發現,活性污泥中微生物群落演替明顯,并且隨反應器內不同時期及環境的變化逐漸演變成適應MBR工藝的群落結構.Chen等[7]利用連續流攪拌槽式厭氧發酵反應器(CSTR)對活性污泥進行馴化培養,在啟動運行階段控制HRT,采用半連續進料,當出水pH值降到5.18時,控制pH值在6.70左右,同時將半連續進料改為連續進料.經過60 d馴化,將活性污泥馴化成理想狀態,并從中篩選到產氫菌種.昌盛等[8]利用厭氧接觸式發酵制氫反應器(ACR)馴化活性污泥,并通過調控反應器pH值考察反應器中產酸發酵類型和產氫性能,發現在不同pH值的控制下,活性污泥中會形成不同的頂級微生物群落結構,使得系統呈現出不同的發酵類型和產氫性能.

本文作者以糖蜜廢水為底物,在CSTR中,進行反應器的啟動運行和活性污泥的馴化,并對反應器運行前后活性污泥的優勢菌群進行分析,以期為厭氧發酵反應器順利完成啟動運行,并實現產氫活性污泥的馴化提供控制參數的參考數據,并為在有機廢水處理的同時制取氫氣提供研究基礎.

1 實驗裝置和方法

1.1 實驗裝置

圖1 厭氧發酵反應器裝置.1 蠕動泵;2厭氧發酵反應器;3攪拌槳;4溫控儀;5濕式氣體流量計

CSTR由有機玻璃制成.反應器的有效容積為5.9 L,整體反應裝置采用密閉設計,反應器攪拌裝置通過軸封保證反應器內部的厭氧環境.配制的甘蔗糖蜜廢水通過計量泵連續泵入反應器中,厭氧發酵反應器產生的氣體從排氣管經過氣體流量計排出.反應器內設有攪拌裝置使活性污泥與底物充分完全接觸和混合.反應器通過水浴加熱裝置將運行溫度控制在(35±1)℃,厭氧發酵反應器的流程圖如圖1所示.

1.2 實驗底物及污泥的培養

實驗采用的底物是甘蔗糖蜜廢水,原料為甘蔗制糖生產過程中經壓榨和濃縮等工序制糖后的剩余廢液,通過稀釋形成一定濃度的甘蔗糖蜜廢水.向糖蜜廢水中投加適量NH4Cl和K2HPO4,使反應器進水中化學需氧量(COD)與氮、磷的質量比控制在:m(COD)∶m(N)∶m(P)=1000∶5∶1.反應器內投加的活性污泥是取自生活污水處理廠初沉池的底泥,經過曝氣培養后接種于厭氧發酵反應器裝置中.

1.3 反應器運行的工程參數控制

反應器的運行主要分為3個階段,分別為反應器啟動運行初期、中期和后期.第一階段從活性污泥投加到反應器中啟動反應器連續運行開始,至反應器運行第29 d.在此階段進水COD控制在3200 mg·L-1左右,運行共29 d.第二階段從反應器運行第30 d至反應器運行第47 d,在此階段進水COD提升到4200 mg·L-1左右,共運行18 d.第三階段從反應器運行第48 d至第58 d,進水COD進一步提升至5500 mg·L-1左右,共運行11 d.反應器啟動運行階段的HRT通過調節反應器的進水流量控制.反應器中投加的活性污泥的混合液懸浮物固體質量濃度(MLSS)為18.4 g·L-1.攪拌槳的轉速控制在130 r·min-1.

1.4 測定方法

COD采用重鉻酸鉀法進行測定[9].使用pH計進行pH值的測定.液相發酵產物的質量濃度采用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用進行測定.采用美國國家環保局方法測定乙醇的質量濃度[10].乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的質量濃度采用氣相色譜法[11]進行測定.活性污泥沉降體積測定方法參考文獻[12].采用Illumina MiSeq測序平臺進行活性污泥優勢菌群分析[13-14].高通量測序主要針對細菌的V3—V4區域進行擴增,采用E.Z.N.ATMMag Bind Soil DNA Kit試劑盒進行厭氧活性污泥的總DNA提取.擴增采用的聚合酶鏈式反應(PCR)引物是Miseq測序平臺的通用引物.341F引物序列為:5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′.805R引物序列為:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′.PCR的反應體系為:2×Taq master Mix 15μL,Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1μL,Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL,Genomic DNA 10～20 mg 加蒸餾水至30 μL.第二輪PCR擴增體系為:2×Taq master Mix 15 μL,Primer F(10 μmol·L-1) 1 μL,Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL,PCR products 20 μL.PCR擴增條件為:預變性94 ℃,3 min后執行94 ℃,30 s;45 ℃,20 s;65 ℃,30 s,共5個循環,然后執行94 ℃,20 s;72 ℃,30 s,共20個循環,最后退火72 ℃,5 min.PCR擴增結束后進行瓊脂糖電泳檢測,觀察電泳結果,進行DNA純化回收.再利用Qubit 3.0 DNA試劑盒對回收的DNA進行精確定量.測序委托上海生工生物工程股份有限公司完成.測序結果與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的BlastX進行序列比對.

2 結果與分析

2.1 反應器啟動運行階段進出水COD的變化規律

圖2 反應器運行過程中進、出水COD濃度及COD去除率的變化情況

COD是反映廢水污染程度的重要指標之一,在糖蜜廢水的厭氧發酵的啟動運行階段,采用較高的進水COD濃度,既可發揮厭氧發酵過程有效處理高濃度有機廢水的優勢,也可加速厭氧反應器的啟動,使其快速完成啟動過程,進入穩定運行階段.厭氧發酵反應器啟動運行階段的進、出水COD以及COD去除率的測定結果如圖2所示.由圖2可知,反應器在運行過程中對高濃度有機廢水的COD具有一定的降解作用.反應器啟動運行初期進水COD控制在3200 mg·L-1左右,此階段COD去除率較低,在3.6%～13.4%之間浮動,這可能與反應器處于啟動運行初期,活性污泥沒有經過長期馴化而未能達到理想的生理狀態有關.反應器啟動運行中期進水COD維持在4200 mg·L-1左右,反應器的COD去除率有明顯的提高,此階段的出水COD基本維持在3500 mg·L-1,平均COD去除率為19%左右.反應器啟動運行后期進水COD為5200 mg·L-1左右.整個階段的COD去除率維持在穩定水平,出水COD為4300 mg·L-1左右,COD的平均去除率達到約20%,其中COD的去除率最高值出現在運行第44 d,為33.7%,此時的進水COD是5504 mg·L-1,出水COD是3651 mg·L-1.進水COD為4200 mg·L-1左右與進水COD為5200 mg·L-1左右時的COD去除率無明顯差異.研究結果表明:厭氧發酵反應器在啟動運行過程中具有一定的COD去除能力,在反應器的進水COD達到較高濃度時,仍具有較為穩定的COD去除率.

2.2 水力停留時間對COD去除率的影響

HRT是指待處理污水在反應器內的平均停留時間,即污水與生物反應器內微生物作用的平均反應時間.對HRT的控制是影響反應器運行的指標之一.在厭氧發酵反應器運行過程中,控制反應器的HRT,觀察COD去除率、出水懸浮物以及活性污泥生物量的變化情況.結果如圖3,表1所示.

由圖3和表1可知,當HRT控制在12 h時,COD去除率最高,是最佳HRT.當HRT控制在6 h時,測得出水懸浮物平均質量濃度為1.897 g·L-1,生物量(質量濃度)由12.7 g·L-1減少到7.0 g·L-1,大量污泥隨出水被沖出.當HRT控制在8 h時,出水懸浮物平均質量濃度為1.224 g·L-1,可觀察到出水中有少量污泥,此時被沖出反應器的污泥量雖然減少,但活性污泥與底物作用時間不夠充分,因此COD的去除率仍然不高.當HRT控制在10 h時,出水懸浮物平均質量濃度為0.467 g·L-1,出水較清,生物量由8.0 g·L-1增加到10.8 g·L-1,并且此階段的COD平均去除率為19.5%,有所提高.當HRT控制在12h時,出水懸浮物平均質量濃度為0.479 g·L-1,出水較清,COD平均去除率為22.8%,進一步提高,生物量也進一步提高到12.6 g·L-1,因此最佳HRT為12 h.HRT過短會導致活性污泥大量沖出,污泥中的微生物大量損失,并且活性污泥中的微生物與底物作用時間不夠充分.HRT適當,則活性污泥中的微生物與底物作用時間充分,并且活性污泥不易被沖出,COD的去除率維持較高水平.控制好HRT能夠為反應器的良好運行提供保障.

圖3 HRT對COD去除率的影響

表1 活性污泥生物量隨HRT的變化關系

2.3 液相發酵產物

液相發酵產物是判斷活性污泥運行狀況的重要指標之一,通過對液相發酵產物含量的分析,可以考察厭氧發酵反應器啟動運行階段微生物菌群的代謝情況,分析反應器中活性污泥的發酵類型.選取啟動運行初期和啟動運行后期的出水樣品,進行發酵液發酵產物的測定.測定結果詳見表2.

表2 反應器啟動運行初期及后期的液相發酵產物的質量濃度 mg·L-1

由表2可知,厭氧反應器啟動運行初期,液相發酵產物中乙醇質量濃度較低,為28.2 mg·L-1,乙酸的質量濃度最高為612.0 mg·L-1,液相發酵產物總質量濃度為1027.2 mg·L-1.在啟動運行初期的發酵產物中,乙酸占有絕對優勢,乙酸的質量占發酵產物總質量的59.6%.在反應器啟動運行后期,乙醇、丁酸和正戊酸的含量均有所增加,液相發酵產物的總質量濃度也增加至1298 mg·L-1.反應器啟動運行后期的發酵產物中,乙酸和丁酸質量占發酵產物總質量的73.1%,屬于丁酸型發酵.對比反應器運行同時間段的COD運行數據發現:反應器啟動運行第5 d,進水COD為3252 mg·L-1;運行至第46 d時,進水COD提高為5486 mg·L-1,這可能是反應器運行后期發酵產物總量上升的主要原因.另外,綜合反應器啟動運行階段的進、出水COD和發酵產物分析可知,雖然在厭氧發酵反應器的運行過程中,整體COD去除率不高,在反應器啟動運行后期COD去除率為16.7%,但在連續運行的厭氧發酵過程中,活性污泥可將糖蜜廢水中的大分子物質降解為乙酸、丙酸、丁酸等小分子物質,厭氧發酵反應器作為兩相厭氧廢水處理工藝中的產酸相,可為后續的廢水處理單元——產甲烷相提供降解后的小分子物質,有利于后續廢水處理單元達到較高的COD去除效果.

2.4 pH值的變化規律

圖4 pH值的變化情況

pH值是影響厭氧發酵反應系統中活性污泥的代謝產物和微生物群落組成的重要工程運行參數[15].在厭氧發酵反應器運行過程中,較高的有機負荷易造成有機酸的大量積累,引起pH值的大幅度下降,影響反應器的發酵性能,這一現象就是厭氧發酵過程中的“酸化”[16-17].CSTR運行過程中進、出水pH值的變化規律如圖4所示.

由圖4可知,在啟動階段,進水pH值維持在6.0～6.5,出水pH值在啟動運行初期出現了劇烈的下降過程.運行第1d,反應器的出水pH值為5.4,運行至第3d時,反應器的出水pH值迅速下降到4.9,此后出水pH值基本維持在4.7～4.9.出水pH值的迅速下降主要是由于反應器中活性污泥微生物厭氧發酵產生較多的酸性發酵產物,酸性發酵產物的大量累積導致pH值的下降.在反應器運行的中期和后期,進水COD逐漸提升到5000 mg·L-1以上,在此過程中,出水pH值一直穩定在4.7～4.9之間,說明反應器內活性污泥菌群在提高容積負荷的條件下仍然具有較高的pH值緩沖能力.

2.5 活性污泥沉降體積分析

實驗采用的反應器為CSTR,在反應器啟動運行期間,始終保持連續進水和連續出水,而且反應器的出水口位于反應裝置頂部,因此反應器內的活性污泥只有保持良好的沉降性能才能避免其隨著出水的連續流動而流失.活性污泥沉降體積是判斷厭氧發酵反應器內部活性污泥運行狀況的重要參數之一.在反應器啟動運行的初期、中期和后期,分別取活性污泥進行污泥沉降體積測試,分析反應器中活性污泥的沉降性能,研究結果如圖5所示.由圖5(a)可知,在反應器啟動運行初期,活性污泥的沉降速度較慢,沉降30 min時,沉降污泥的體積分數為66%;經過長達1 h的沉降后,沉降污泥的體積分數為55%,沉降性能較差.觀察發現,啟動第1 d投入反應器中的活性污泥呈現黑色,肉眼無法觀察到片狀絮凝污泥.在反應器運行到第45d時,污泥沉降體積結果如圖5(b)所示,在沉降30 min時沉降活性污泥的體積分數為46%,沉降1h后的沉降體積分數為36%,此時期活性污泥的沉降速度逐漸提高,沉降性能有所改善.當反應器運行到第57 d,污泥沉降體積結果如圖5(c)所示,沉降30 min時沉降活性污泥的體積分數為37%,沉降1 h時沉降污泥的體積分數為28%.反應器啟動運行后期,污泥沉降速度較快,此時反應器中的活性污泥具有良好的沉降性能.觀察發現,此時的活性污泥呈現黃棕色,形成明顯的片狀絮凝污泥.由此可知,活性污泥在反應器內經過較長時間的馴化后,具備了較好的沉降性能.

圖5 反應器啟動運行(a) 初期,(b) 中期,(c) 后期污泥沉降體積變化

2.6 啟動初期和啟動后期活性污泥的優勢菌群對比分析

在反應器啟動運行的過程中,選取反應器啟動運行初期(第3 d)和啟動運行后期(第59 d)的活性污泥進行了馴化前后的活性污泥優勢菌群對比分析.表3和表4分別為反應器啟動運行初、后期活性污泥中的優勢菌群組成.由表3,4可知,活性污泥在投加到反應器的初始階段,活性污泥中的微生物種類較豐富,其中Spartobacteria微生物的總體數量較高,在活性污泥微生物總量中的物種豐度比例為26.10%,其他微生物的占比均不高.產乙醇桿菌屬(Ethanoligenens)在啟動運行初期僅占活性污泥微生物總量的1.43%,梭菌屬(ClostridiumⅣ)占活性污泥微生物總量的4.69%.經過60 d左右的反應器運行和活性污泥馴化,在反應器啟動運行后期,活性污泥的微生物種類發生巨大變化,優勢菌群分別為產乙醇桿菌屬(Ethanoligenens)、巨型球菌屬和梭菌屬.其中,產乙醇桿菌屬的菌數占活性污泥微生物總量的24.16%,巨型球菌屬(Megasphaera)為21.44%,梭菌屬(ClostridiumⅣ)為15.52%.研究結果表明:經過馴化后的活性污泥中與產氫功能相關的菌種屬占活性污泥中微生物總量的40%以上[18-19].其中,Clostridiums.s和ClostridiumIV等梭狀芽孢桿菌屬具有水解產酸代謝功能,同時還具有產芽孢和耐酸的特性[20].Spartobacteriagenera_incertae_sedis屬的水平分類未定,相關背景資料較少[21].研究結果表明:在反應器啟動運行期間,通過控制進水COD和進、出水pH值,可實現活性污泥菌群的定向馴化,使之形成與產氫功能密切相關的優勢菌群.

表3 反應器啟動運行初期活性污泥的優勢菌群對比

表4 反應器啟動運行后期活性污泥的優勢菌群對比

3 結 論

CSTR在溫度為35 ℃,進水COD從3200 mg·L-1逐漸增加至5500 mg·L-1的條件下啟動運行,經過60 d左右可較好地完成反應器的啟動過程,形成較為穩定的運行狀態,實現活性污泥的定向馴化.

在反應器運行較為穩定的啟動運行后期,反應器出水的液相發酵產物總量為1298 mg·L-1,其中乙酸和丁酸質量占發酵產物總質量的73.1%,形成丁酸型發酵的主要發酵產物.分析認為,反應器的pH值是影響反應器發酵類型的重要因素,啟動運行階段的發酵產物形成丁酸型發酵與反應器出水pH值基本穩定在4.7～4.9有關.大量研究表明,當CSTR運行階段的出水pH值在4.0～4.5時,反應器的液相發酵產物通常以乙醇和乙酸為主,形成乙醇型發酵;當反應器出水pH值為4.5～5.0時,反應器基本形成丁酸型發酵,產生以乙酸和丁酸為主的發酵產物;當反應器出水pH值為5.0以上時,反應器更容易形成混合酸發酵,此時乙醇、乙酸、丙酸、丁酸等多種發酵產物同時存在,且沒有發酵產物占有絕對優勢[22-24].綜上所述,在反應器的運行中通過控制進水COD的濃度,進而使反應器出水pH值控制在一定范圍內,可有效實現反應器啟動階段的發酵類型控制.

反應器啟動運行過程中經過馴化的活性污泥,形成以產乙醇桿菌屬(Ethanoligenes)、巨型球菌屬(Megasphaera)和Ⅳ型梭菌(ClostridiumⅣ)為主的優勢菌群.其中產乙醇桿菌和Ⅳ型梭菌均為產氫能力較高的產氫菌株,在每摩爾葡萄糖中的產生氫氣的最大物質的量分別為2.81 mol和1.57 mol[25-26],因此在厭氧發酵反應器啟動運行期間,通過COD和pH值的參數控制,可實現活性污泥菌群的定向馴化,形成以產氫為主的功能性菌群,產氫功能性菌群占活性污泥微生物總量的40%以上.