兔眼藍莓組培體系建立及多倍體誘導研究

何夢鈴 楊娜 劉小珍

摘要 ? ?藍莓具有較高的營養價值和經濟價值，但其繁殖速度慢、果實較小、采摘成本高，優化現有的藍莓品種具有良好的發展前景。本文以兔眼藍莓燦爛幼嫩莖段為試驗材料開展組織培養研究，采用不同的培養基配比激素以及設置不同濃度用以研究出最適合兔眼藍莓燦爛生長的、穩定的、可重復性強的培養基配方，建立葉片再生體系，并采用秋水仙素培養基添加法對其進行誘導。在無菌條件下切取由葉片再生形成的長勢較好苗的帶葉莖尖（長約0.5 cm），接種到秋水仙素濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L的6種培養基中。結果表明，最適兔眼藍莓燦爛腋芽啟動培養基是配方WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導效果最佳，發芽率高達93%以上;取離體葉片再生芽苗的莖尖進行共培養誘導多倍體，50 mg/L秋水仙素處理50 d和60 mg/L秋水仙素處理30 d或40 d時，誘導植株變異的效果最佳，變異率均達30%以上。

關鍵詞 ? ?兔眼藍莓;組織培養;秋水仙素;培養基添加法;多倍體

中圖分類號 ? ?S663.9 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）23-0059-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?Blueberry has high nutritional value and economic value，but its propagation speed is slow，the fruit is small，the harvesting cost is high，so the optimization of existing blueberry varieties has a good development prospect. In this study，the young stem segment of Vaccinium ashei ′Brilliant′ was used as the experimental material to carry out tissue culture research. Different ratios and concentrations of hormones were used to develop the most suitable component for the stable and reproducible culture medium of V. ashei ′Brilliant′.The leaf regeneration system and polyploidy induction system were established，and it was induced by colchicine medium addition method. Under sterile conditions，the leaf tips of the growing seedlings （about 0.5 cm long） formed by leaf regeneration were inoculated into 6 mediums containing colchicine concentration of 10，20，30，40，50，60 mg/L. The results showed that the optimal axillary bud initiation medium for V. ashei ′Brilliant′ was WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L sucrose+6 g/L agar，the inducing effect was the best，and the germination rate was over 93%. The leaf tips of the growing seedlings formed by leaf regeneration in vitro was co-cultured to induce polyploidy，when treated with 50 mg/L colchicine for 50 d and 60 mg/L colchicine for 30 d or 40 d，the plant variation effect was the best，the variation rate was over 30%.

Key words ? ?Vaccinium ashei;tissue culture;colchicine;medium addition method;polyploidy

藍莓為杜鵑花科（Vacciniaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，是一種多年生灌木小漿果果樹[1]。藍莓是越橘屬中經濟價值較高的一種，其生態適應性、長勢和抗病蟲性較強，且品質佳，口感好，主要優良品種有杰兔、燦爛、園藍、巨豐等[2]。其果實中含有豐富的營養成分，具有增強人機體免疫、軟化血管、抗癌、強心、保護視力、防止腦神經老化等功能。作為一種新的經濟類型水果，也被廣泛用于鮮果、飲料、保健用品等食用形式，需求量較大。因此，藍莓具有較高的經濟價值，有較好的經濟發展前景。

隨著我國對藍莓引種栽培規模日益擴大，優良種苗需求量急劇增加。藍莓的傳統繁殖方法主要是扦插法繁殖和嫁接繁殖法，這種方法繁殖速度慢，其種苗生產仍然供不應求。而組織培養可以在藍莓的任意生長階段進行擴繁，可以迅速去除藍莓中病毒，變異性小，且可在較小空間內快速地獲得大量無性系組培苗。因此，組織培養更能滿足快速發展藍莓栽培的需要。

關于藍莓的組織培養擴大繁殖，國外已有大量的報道。目前，已經在高叢、矮叢及兔眼藍莓的多個類群中進行了離體再生的研究[3-11]。

目前普遍栽培的兔眼藍莓為二倍體，存在營養物質含量和產量相對較低、果實較小的缺陷，而多倍體藍莓不僅生長勢和抗性強，且果實產量高、品質好、果大。多倍體育種對于兔眼藍莓的耐貯性、抗逆性和增大果個等特性有很大的提高[12]，能培育出更有經濟價值的品種。

藍莓品種的多倍體誘導是多倍體離體誘導的重要研究對象且藍莓果實較小，不適宜機械采收，人工采收費用高，而多倍體植株在遺傳學上具有巨大性。為解決繁殖系數低、果小、病毒等問題，本研究擬以兔眼藍莓優良單株進行組織培養，確立最適合兔眼藍莓生長的、穩定的、可重復性強的培養基配方，建立組培體系，進而對長勢較好的莖尖進行多倍體誘導，獲得的變異植株可用作于兔眼藍莓的多倍體研究從而解決果個小等問題。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?供試材料

采用生長旺盛的燦爛品種的嫩枝作為試驗材料，所有的外植體材料均采自西南林業大學優良藍莓種質資源圃。

1.2 ? ?兔眼藍莓葉片再生體系建立

1.2.1 ? ?外植體的選擇與消毒。選取燦爛的當年生嫩莖，去除葉柄和葉片，用肥皂水洗凈，在線狀自來水下沖洗1～2 h，剪成1～2 cm長、含1～2個葉腋的莖段，放于滅過菌的外植體缸內，移至超凈工作臺上，并設計不同處理時間、不同濃度組合處理的消毒方法，放于滅過菌的墊有濾紙的接種盤內，使濾紙能夠吸干外植體表面的殘留水分。在接種7 d后統計污染率。每個處理組合接種30瓶，重復3次。最終確定處理組合5（75%酒精18 s、0.1%升汞10 min、暗培養7 d）為最優消毒方案，污染率僅為3.3%，發芽率高達93%。

1.2.2 ? ?腋芽誘導與增殖培養。不定芽增殖正交實驗，影響因素包括ZT、NAA。具體方案如表1所示。將莖段兩端分別切去2～4 mm，平放在啟動培養基上，葉腋朝上，接種在各種不同激素組合的培養基中，其中含20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，pH值為5.7～6.0。置于暗培養環境即培養溫度（25±3）℃、暗培養8～10 d，再置于晝培養環境即培養溫度（25±3）℃、光照16 h/d、光照度為2 000 lx培養8周后，統計腋芽數量。每個處理組合接種30瓶，重復3次。最終確定最佳腋芽誘導培養基為5號處理，即WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT，誘導率為93%以上。

待腋芽發出時，將外植體轉到繼代培養基上，用于芽的伸長生長，繼代培養基的配方為：WPM+0.05 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH值為5.7～6.0。置于晝溫（25±3）℃、光照16 h/d、光照度為2 000 lx培養的條件下培養3周后，腋芽長出2～3 cm高腋芽，同時剪下腋芽進行增殖培養，建立組培體系。

1.3 ? ?多倍體誘導

采用陳冰心[2]的多倍體誘導方法（培養基添加法）并稍作改變，設秋水仙素的濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L，不同濃度下分別處理10、20、30、40、50 d。首先，在無菌條件下切取由葉片再生形成的長勢較好苗的帶葉莖尖（長約0.5 cm），接種到秋水仙素濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L的6種培養基中，以不含秋水仙素的培養基作為空白對照組。在溫度（25±3）℃、光強2 000 lx、光周期16 h光照/8 h黑暗的環境中，受不同濃度秋水仙素處理的莖尖，每種濃度分別進行10、20、30、40、50 d的共培養（即不包括空白對照有30個處理），每個培養瓶中接種7個左右的莖尖，每個處理重復3次。共培養結束后，在超凈工作臺上將莖尖取出，接種到不含秋水仙素的WPM培養基中繼續培養。培養期間，每隔10 d觀察1次，并統計其存活率[13-14]，計算公式如下：

存活率（%）=（存活個數/接種個數）×100

經過一段時間的培養，對比未經過秋水仙素處理的植株生長情況，觀察并統計經過秋水仙素共培養處理后出現明顯變異的植株，如具有植株表皮毛較多、葉片更厚、顏色更濃綠、莖桿較為粗壯、分枝能力增強、節間變短等特征的植株，以便進行初步的加倍植株的篩選，統計變異率[15-16]。計算公式如下：

變異率（%）=（出現形態變異的個數/接種個數）×100

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?秋水仙素處理濃度和時間對兔眼藍莓外植體存活率和形態變化的影響

適宜濃度的秋水仙素能夠破壞分裂中期的紡錘絲，導致復制的染色體不能向兩極移動，從而使細胞中染色體組加倍[2]。

本試驗用培養基添加秋水仙素的方法誘導多倍體苗，在誘導培養過程中發現，處理相同時間的情況下，秋水仙素濃度越高的苗生長越緩慢，如圖1所示。在10 mg/L秋水仙素處理40 d的培養條件下，幼苗生長較快，莖較細;而在50 mg/L秋水仙素處理50 d的培養條件下，幼苗生長較緩慢，并出現了莖加粗的幼苗。

從表2可以看出，隨著處理濃度的增大，外植體的平均存活率越低，當處理濃度為10 mg/L時，作用效果不明顯，平均存活率為99.42%;當處理濃度為60 mg/L時，平均存活率則只有75.42%。而隨著處理時間的延長，存活率有下降的趨勢，但是影響效果不是特別明顯。