德宏州番茄病毒病發(fā)生情況調(diào)查及其毒源種類分析

張培花 王根權(quán) 李翱

摘要 ? ?對(duì)德宏州番茄主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查并對(duì)采自德宏州4個(gè)縣市的85份番茄樣品進(jìn)行了DAS-ELISA、dot-ELISA檢測以及PCR檢測。結(jié)果表明，番茄病毒病在德宏州主要番茄主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為黃化曲葉、皺縮、矮化、花葉、脈突、蕨葉、葉片發(fā)紫，單獨(dú)或混合發(fā)生，一般發(fā)病率為5%～30%，甚者達(dá)80%以上，個(gè)別田塊達(dá)100%。在檢測的85份樣品中，有58份番茄樣品感染了所檢測病毒，病毒檢出率為68.24%，病毒種類有12種，其中以雙生病毒科的泰國番茄黃化曲葉病毒為主，占27.06%，其他依次是番茄斑萎病毒屬番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（22.41%）、煙草曲莖病毒（7.06%）、中國番茄黃化曲葉病毒（5.17%）、越南番茄黃化曲葉病毒（3.45%）。

關(guān)鍵詞 ? ?番茄病毒病;發(fā)病情況;毒源種類;云南德宏

中圖分類號(hào) ? ?S436.412.1+1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2019）23-0120-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

番茄經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，在世界各地得到廣泛栽培。受栽培制度、品種等因素影響，番茄病蟲害防治存在一定的難度，尤其是病毒病。病毒病在我國南北種植區(qū)發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重[1]。番茄作為冬早蔬菜種植的主要品種，已成為德宏州冬農(nóng)開發(fā)的新亮點(diǎn)，但因常年連作、栽培管理和防治措施不到位，導(dǎo)致冬、春季番茄病毒病日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，國際上已報(bào)道危害番茄的病毒超過30種[2]，我國先后檢測出13種病毒[3-7]，對(duì)德宏州番茄病毒病的毒源種類還未進(jìn)行過系統(tǒng)的研究。本文利用DAS-ELISA和dot-ELISA技術(shù)對(duì)采自德宏州4個(gè)縣市的番茄病毒病樣品進(jìn)行了8種茄果類蔬菜常見病毒的血清學(xué)檢測，利用PCR技術(shù)對(duì)番茄雙生病毒進(jìn)行了檢測，以期為番茄病毒病的防治提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)作物為番茄，調(diào)查對(duì)象為番茄病毒病。

供試試劑有INSV、IYSV和GRSV/TCSV復(fù)合抗血清，購自美國Agdia公司;TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗體，由德宏州植保植檢站實(shí)驗(yàn)室制備;TSWV單克隆抗體，由浙江大學(xué)周雪平教授提供。

1.2 ? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ? ?樣品采集。2015年11月至2017年2月在德宏州芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣4個(gè)縣市番茄種植田塊調(diào)查番茄病毒病發(fā)生情況，采集典型病毒病癥狀的番茄葉片、嫩梢或果實(shí)樣品，對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)和癥狀記錄，并分別裝入已標(biāo)記的自封袋中，放入-20 ℃的冰箱中冷凍保存，備用。

1.2.2 ? ?病毒病原檢測。分以下2種進(jìn)行。

（1）番茄斑萎病毒屬病毒檢測。采集感病的典型番茄斑萎病毒病害樣品分別用tospoviruses抗血清進(jìn)行DAS-ELISA和dot-ELISA檢測。用于dot-ELISA的 TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗體按照1/3 000進(jìn)行稀釋，TSWV單克隆抗體按照1/3 000進(jìn)行稀釋。

（2）菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測。典型雙生病毒病害癥狀病株葉片總DNA采用CTAB法提取[8]。利用菜豆金色花葉病毒屬病毒簡并引物PA/PB進(jìn)行PCR檢測，菜豆金色花葉病毒屬病毒基因共同區(qū)及外殼蛋白保守區(qū)約500 bp的基因片段[9]是該引物擴(kuò)增的目的條帶。與此同時(shí)，利用beta衛(wèi)星通用引物β01/β02和alpha衛(wèi)星通用引物UNA101/UNA102對(duì)雙生病毒典型病株進(jìn)行PCR檢測，這2對(duì)引物的目的條帶分別為其衛(wèi)星全長[10-11]。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 μmol/L dNTPs 2 μL、20 μmol/L上游、下游引物各0.5 μL、5 U/μL Taq Plus DNA聚合酶0.5 μL、植物總DNA 125 ng，加雙蒸水定容至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min;94 ℃變性45 s，50℃退火45 s，72 ℃延伸50/90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。紫外燈下割取目的片段，利用Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化，回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy（Promega，Madison，WI）載體上，通過熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆，送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?番茄病毒病發(fā)生情況

根據(jù)2015—2017年田間調(diào)查，在德宏州芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)等番茄主產(chǎn)區(qū)均發(fā)生了番茄病毒病，癥見黃化曲葉、皺縮、矮化、蕨葉、花葉、脈突、葉片發(fā)紫，單獨(dú)或混合發(fā)生，一般發(fā)病率為5%～30%，甚者達(dá)80%以上，個(gè)別田塊達(dá)100%。芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)露地番茄黃化曲葉癥狀比較明顯，以點(diǎn)、片發(fā)生為主。瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)大多為大棚栽培，栽培管理較好，番茄病毒病發(fā)病較輕，發(fā)病率大部分在5%以下。

2.2 ? ?番茄樣品的病毒種類分析

2015年11月至2017年2月在德宏州芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣4個(gè)縣市采集了85份番茄樣品進(jìn)行病毒病檢測，其中有58份番茄樣品帶毒，病毒檢出率為68.24%，病毒種類有12種，其中以雙生病毒科的泰國番茄黃化曲葉病毒為主，占27.06%，其次是番茄斑萎病毒屬的番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（TZSV），占22.41%，煙草曲莖病毒占7.06%，中國番茄黃化曲葉病毒占5.17%，越南番茄黃化曲葉病毒占3.45%。芒市檢測到5種病毒，泰國番茄黃化曲葉病毒是芒市番茄上的優(yōu)勢毒源，檢出率為46.88%，其次是TZSV、泰國番茄黃化曲葉病毒、番茄黃化曲葉病毒，檢出率均為9.38%，再次是PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒），檢出率為3.12%。瑞麗市檢測到3種病毒，主要以泰國番茄黃化曲葉病毒為主，檢出率為40%，其次是泰國番茄黃化曲葉病毒Beta衛(wèi)星和木耳坦棉花黃化曲葉病毒Beta衛(wèi)星，檢出率為10%。隴川縣檢共測到4種病毒，TZSV是隴川縣番茄上的優(yōu)勢毒源，檢出率為40.91%，其次是煙草曲莖病毒，檢出率為22.73%，再次是PaMMV和朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒，檢出率均為4.55%。盈江縣檢測到 6種病毒，主要以泰國番茄黃化曲葉病毒為主，檢出率為19.05%，其次是越南番茄黃化曲葉病毒和勝紅薊黃脈病毒Beta衛(wèi)星，檢出率均為9.52%，再次是TZSV、WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒）和煙草曲莖病毒，檢出率均為4.76%。

3 ? ?結(jié)論與討論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄病毒病在德宏州芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)、瑞麗市勐卯鎮(zhèn)等番茄主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)露地番茄黃化曲葉癥狀比較明顯，以點(diǎn)、片發(fā)生為主。瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)大多數(shù)為大棚栽培，栽培管理比較好，番茄病毒病發(fā)病較輕，發(fā)病率大部分在5%以下。這表明栽培管理措施是控制病毒病發(fā)生的關(guān)鍵因素。

在德宏州芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣4個(gè)縣市采集了85份番茄樣品進(jìn)行病毒病檢測，其中有58份番茄樣品帶毒，病毒檢出率為68.24%，病毒種類有12種。這表明德宏州番茄病毒病種類較多，并且各縣市的病毒種類和優(yōu)勢毒源存在較大差異，泰國番茄黃化曲葉病毒是芒市、瑞麗市、盈江縣番茄上的優(yōu)勢毒源，TZSV是隴川縣番茄上的優(yōu)勢毒源。

研究表明，番茄上的病毒種類有很多[2-7]。由于本試驗(yàn)采集樣品數(shù)量和檢測的病毒種類有限，因而引起本地區(qū)番茄病毒病的毒源可能還有其他種類，這還需進(jìn)一步的檢測鑒定。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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