基于熒光定量PCR的羊絨、牦牛絨混合物定量檢測方法

費靜 孫世元 王濤 魏曉英 張回飛

摘 要：物種相近、理化性質相同的特種動物纖維在外觀形態上十分相似，難以鑒別，常見的有羊絨/羊毛，駝絨/羊駝絨等。然而，羊絨中的紫羊絨，與細度相近的牦牛絨混合在一起，更難辨別，是檢測中的難點，也是目前市場摻假的主要原因。目前，特種動物纖維的檢測主要借助顯微鏡或者電鏡觀察形態而鑒別，依賴檢驗人員的經驗進行判斷，主觀性較強。本研究從毛發自帶的物種特異性的DNA出發，借助熒光定量PCR技術，建立羊絨和牦牛絨的定量標準曲線，實現這兩種混合物的定量檢測。

關鍵詞：羊絨;牦牛絨;熒光定量PCR;DNA定量檢測

中圖分類號：TS137

文獻標志碼：A

文章編號：1009-265X（2019）05-0034-05

Abstract：It is hard to identify the fibers of some special animals with close relation in species， physical and chemical properties due to the similar appearance， such as cashmere/wool and camel hair/alpaca fiber. It is even difficulty to identify purple cashmere when it is mixed with yakwool which owns the similar diameter. This is also the main reason of adulteration in the market. Nowadays， special animal fibers are mainly identified by microscopic or SEM examination according to their fiber appearances， which is limited and subjectively by experience of detection personnel. This research focused on species-specific DNA extracted from animal hair， and a quantitation standard curve for cashmere and yakwool was established with the help of fluorescent quantitative PCR technology to achieve quantitative detection of the mixture of the two.

Key words：cashmere; yakwool; fluorescent quantitative PCR; DNA quantitative detection

隨著人們對綠色生活方式的倡導，傳統的特種動物纖維產業又蓬勃發展起來。羊毛、羊絨、駝絨、牦牛絨纖維等均為秋冬季最受歡迎的保暖紡織材料。

羊絨產自山羊，是山羊外表皮特有的一層薄薄地掩在粗毛根部的細絨，僅占動物纖維總產量的0.2%，羊絨以纖細、滑糯，并兼以柔軟、保暖等特點著稱，被稱為纖維界的“鉆石”、“軟黃金”，稀缺性和珍貴性導致了羊絨的價格高高在上，遠高于一般的羊毛產品。中國是最大的羊絨輸出國，產量約占全世界產量的四分之三，出口創匯可觀。山羊絨產業是西部經濟的助推器，也是牧民增收的主要來源，對西部經濟有著重要意義。

牦牛是一種能在高原高寒的惡劣環境下生存的哺乳動物，是牛科動物唯一有紡織利用價值的成員。牦牛被稱為高原之舟，生長于青藏高原及其毗鄰地區的高寒地帶。牦牛厚厚長長的毛層下聚集著細密的絨毛，這些絨毛為牦牛在高寒的天氣狀況下生存提供了可能。中國是世界上牦牛數目最多的國家，約占全世界總數的90%。牦牛絨很細，直徑18～20 μm，長度為35～50 mm，有不規則彎曲，鱗片呈環狀緊密抱合，光澤柔和，彈性強，手感滑糯[1]。

絕大多數牦牛絨呈棕色。牦牛絨與紫山羊絨在外表形態上很相似，鱗片的密度、厚度也相近，纖維邊緣整齊，平滑，且兩者在顯微鏡下均存在色素團，給鑒別工作帶來了困難[2]。一些不法分子利用這一相似性，將牦牛絨充作紫山羊絨坑害消費者，從中牟利。中國現行的標準GB/T 16988—2013《特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定》對牦牛絨的描述：牦牛絨纖維鱗片張角較小，鱗片密度為100～130個/mm，毛色為黑色、棕褐色。而在一般的光學顯微鏡下，鱗片并不是很清晰，檢測起來費時費力。電鏡法成本高，且制樣比較煩瑣。由于本身帶有色素，紫山羊和牦牛絨通常會被制成深色的織物，這就進一步給檢測鑒別工作增加了難度[3-4]。圖1是顯微鏡下的紫山羊絨和牦牛絨。

DNA檢測近年來在食品、動植物檢疫、司法和環境監測中得到廣泛應用。熒光定量PCR技術，是一種加入了熒光基團的體外模擬DNA擴增的技術（PCR）。

在PCR反應體系中加入熒光基團，熒光信號的積累在一定程度上反映了整個反應的進度，每增加一條DNA新鏈就能捕捉到一個熒光分子信號，同步化了熒光信號和PCR產物的積累，最后通過曲線對未知模板進行定性或定量分析[5-6]。

本研究提供了一種基于熒光定量PCR技術的山羊絨、牦牛絨纖維混合物的定量鑒別方法。針對山羊、牦牛的線粒體DNA序列設計物種特異的引物和探針，利用實時熒光PCR技術，建立起山羊絨牦牛絨標準混合物與它們的DNA之間的對應關系。未知樣品的檢測可以通過對其中山羊源成分、牦牛源成分進行定量檢測，通過對照標準曲線求得各自的含量。

1 試 驗

1.1 試驗材料

用于制作標準曲線的紫山羊絨購自內蒙古，牦牛絨購自專門生產牦牛絨產品的Shokay公司。

1.2 主要實驗試劑

毛發抽提、純化試劑盒（Promega公司，貨號DC6701，DC6740）;2×TaqMan universal master Mix（ABI公司，貨號4440040）;引物、探針由life science公司合成，具體序列見1.6。

1.3 主要儀器和器具

熒光定量PCR儀（ABI公司，型號7500）;高速渦旋振蕩儀;冰箱;天平（梅特勒公司，型號AE240）;液氮冷凍研磨儀（美國SPEX公司，型號6870）。

1.4 標準混合樣和標準曲線的制備

使用直徑相近的100%的羊絨、100%的牦牛絨纖維自制標準混合樣。分別稱取羊絨含量為10%，30%，50%，70%，90%，總質量為0.5 g山羊絨、牦牛絨混合物。

1.5 DNA提取

把樣品均勻混合，使用液氮冷凍研磨儀或是剪刀粉碎纖維，確保纖維長度小于0.2 mm。使用Promega DNA IQTM毛發抽提試劑盒抽提DNA。稱取纖維粉沫10 mg置于1.5 mL離心管中，加入200 μL DTT和150 μL蛋白酶K，56 ℃溫浴震蕩過夜;第二天加入裂解液700 μL，上下顛倒混合幾次;短時間離心沉淀未溶解物質，吸取上清液轉移至新的1.5mL離心管中，加入7μL 完全懸浮的DNA IQTM樹脂，高速渦旋振蕩3 s，室溫溫浴10 min;高速渦旋振蕩2 s，將離心管置于磁分離架上，此時吸附的DNA的磁球緊貼管壁;用移液槍除去含雜質的溶液;再加入100 μL裂解液，高速渦旋振蕩2 s，將離心管置于磁分離架上;去除所有的裂解液，加入150 μL洗滌液，高速渦旋振蕩2 s，將管子置于磁分離架上，視情況重復洗滌2～3次，除盡洗滌液;打開管蓋，空氣中干燥5 min;加入70 μL洗脫液，高速渦旋振蕩2 s，65 ℃溫浴5 min;取出離心管，高速渦旋振蕩2 s，置于磁分離架上，小心吸取DNA溶液（整個過程可參見Promega DNA IQTM使用說明）。

1.6 real-time PCR引物設計

收集了NCBI數據庫中山羊、牦牛的線粒體基因序列，重點關注了DNA（mtDNA）16S rRNA基因，12S rRNA基因，細胞色素b基因（cytb），控制區（D-LOOP），ND4基因，挑選了種內保守、種間存在差異區域的12srRNA基因區域。所設計的引物和探針見表1。

1.7 Real-time PCR反應體系與擴增條件

2×Taqman universal Master Mix 10 μL，10 μmol/L引物各0.8 μL，DNA抽提液4 μL，2 μmol/L探針2.5 μL，H2O 2.7 μL。每個樣品山羊引物和探針檢測一次，牦牛引物和探針檢測一次，每種引物探針3個復孔。擴增程序：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60 ℃，30 s，共40個循環。使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴增。

1.8 標準曲線的建立

使用液氮冷凍研磨儀粉碎標準混合物。對標準混合物進行DNA抽提，每個混合比例4個獨立的樣品。根據步驟1.7進行熒光定量PCR檢測。根據熒光定量PCR的數學原理可以推導出，當兩個反應的擴增效率非常接近時，羊絨與牦牛的比值的對數與兩者對應的Ct值之差存在一定的關系。

對儀器采集到的針對每個標準混合物的山羊絨Ct值記為Ctcashmere，牦牛絨Ct值記為Ctyak，求得Ctcashmere-Ctyak兩者的差值ΔCt為橫坐標，以log（1/9）、log（3/7）、log（5/5）、log（7/3）、log（9/1）的值為縱坐標，進行曲線擬合，建立定量標準曲線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以4個獨立批次樣品的羊絨檢測Ct值與牦牛檢測Ct值之差的平均值為橫坐標，羊絨和牦牛的比值的對數為縱坐標（表2）取點進行曲線擬合，得一直線（圖2），且R2>0.99。

對未知樣品，收提DNA，使用山羊、牦牛引物和探針對DNA進行檢測，對照標準曲線即可倒推出樣品中羊絨和牦牛的含量。

2.2 幾個點的驗證

使用50%淺棕色、50%深棕色牦牛絨混合物，再與紫山羊絨混合，其中羊絨含量為10%，50%，90%，各取5個獨立混合樣品進行檢測。結果如表3。

2.3 方法應用

使用該方法對1個送檢面料，2個CCMI（國際山羊絨駝絨制造商協會）的樣品進行檢測。樣品1 客戶申報為100%山羊絨，樣品2，3為比對樣品。檢測結果見表4。

2.4 方法的精密度

通過5個獨立實驗，對樣品1（山羊絨10%/牦牛絨90%）;樣品2（50%山羊絨/50%牦牛絨）;樣品3（90%紫山羊絨/10%牦牛絨的混合物）進行檢測，收集數據對方法的精密度進行評估。5個實驗室的數據見表5。

對5個實驗室的數據進行柯克倫檢驗和格拉布斯檢驗，沒有發現有歧離值或離群值存在。分別對3個樣品進行統計分析，計算總平均值m，重復性標準差Sr和再現性標準差SR，從而算得重復性限r和再現性限R，結果如表6所示。具體計算公式參考GB/T 6379.2—2004《測量方法與結果的準確度 第2部分 確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》。

對表6進行分析，方法精密度與平均值之間沒有明顯的依賴關系。取最R和r作為重復性和再現性的最終值，重復性限r=3.4%，再現性限R=4.8%。

3 結論和討論

本研究采用了DNA檢測手段開展了羊絨、牦牛絨混合物的定量檢測，通過構建標準曲線，建立起山羊絨、牦牛絨含量與它們DNA含量之間的關系，實現了山羊絨、牦牛絨定量檢測。同時，選擇了3個水平的含量對方法的重復性和再現性進行了評定，分別為3.4%和4.8%。

由于紫羊絨、多數牦牛纖維均含有色素，歷來是檢測的難點。從這兩種纖維的遺傳物質入手，實現了儀器檢測，可以避免檢測人員主觀因素的影響。由于色素對PCR擴增有抑制作用，在DNA抽提時建議使用磁珠試劑盒法，可以有效去除PCR的抑制因素。

DNA檢測，高質量的DNA是基礎。所謂高質量的DNA，包含兩層意思，一是DNA的量要達到熒光定量檢測反應的檢測低限，另一層是DNA盡量完整，若鏈全部斷裂則無法檢測。機絨處理、后整理中的化學助劑等均會對DNA的完整性造成一定 的影響。而PCR的有效擴增，有賴于兩段引物之間的DNA的完整性，將擴增序列設計在線粒體12srRNA上，且大小在70個堿基對左右，可以最大限度地提高有效DNA的利用。

在實際生產過程中，有些企業會對牦牛絨進行剝色處理，為的是使之更容易染色，或是能更接近羊絨外觀。遇到這樣的樣品須格外謹慎，如果僅牦牛絨進行了氧化剝色處理，是無法用DNA方法進行定量檢測的，因為氧化劑會對DNA鏈造成損傷，而兩個組分的損傷程度不一致，會使檢測的牦牛絨含量偏低[6]。當牦牛絨與羊絨的損傷程度不一致時，定量的結果就會發生偏差。反言之，如果兩者進行同樣的剝色處理，那損傷程度近似，還是可以利用這個方法進行檢測。

參考文獻：

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[6] 費靜，唐敏峰，楊娟，等.DNA檢測技術在天然動物纖維鑒別中的應用[J].紡織導報，2012（5）：90-91.